胡浩然，　宣佳利，　楊解人，　李　偉，　趙夢秋，　韓　軍

(皖南醫(yī)學院藥理學教研室，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實驗室， 安徽 蕪湖 241002)

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芝麻素改善自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷的作用及與PI3K/AKT/mTOR信號通路的關系*

胡浩然▲，宣佳利▲，楊解人，李偉，趙夢秋，韓軍△

(皖南醫(yī)學院藥理學教研室，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實驗室， 安徽 蕪湖 241002)

目的： 觀察芝麻素對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)腎臟損傷的作用及與PI3K/AKT/mTOR信號通路之間的關系。方法: 雄性SHR隨機分成模型組、芝麻素低劑量(80 mg/kg)、高劑量(160 mg/kg)組及卡托普利(30 mg/kg)組。同時選取同周齡WKY大鼠作為正常對照組。每日灌胃1次，模型組、正常對照組給予0.5 %羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，給藥組給予CMC-Na溶解的上述劑量藥物，給藥前及給藥后每隔2周測量1次血壓。12周后，檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)及尿微量白蛋白(U-mAlb)含量；測定腎臟丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平；HE、Masson染色觀察腎組織病理學變化；TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡率；Western blot法檢測腎臟p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1、Bcl-2和Bax的蛋白水平。結(jié)果: 芝麻素能降低SHR舒張壓，明顯改善腎組織的病理學變化，降低腎臟BUN、SCr、U-mAlb、MDA含量及細胞凋亡率，提高SOD活性，顯著減少p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1和Bax的蛋白水平，增加Bcl-2的蛋白表達。結(jié)論: 芝麻素減輕SHR大鼠腎臟損傷的作用機制可能與降低血壓、對抗氧化應激、抑制細胞凋亡、阻滯過度活化的PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。

芝麻素； 自發(fā)性高血壓大鼠； PI3K/AKT/mTOR信號通路； Bax； Bcl-2

高血壓腎病是原發(fā)性高血壓最嚴重的并發(fā)癥之一，可致多尿、夜尿，繼而尿量減少，最終發(fā)展至慢性腎衰竭或尿毒癥從而危及生命[1]。芝麻素(sesamin，Ses)是從芝麻中提取出來的一種木脂類有效活性成分，具有降低血壓、血脂，抗氧化、抗腫瘤及保護與改善肝腎功能等藥理作用[2]。本課題組前期實驗已表明，Ses對高血壓腎損傷具有拮抗作用，但深入的機制尚不明了[3]。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)為研究對象，觀察Ses改善高血壓腎損傷的作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路之間的關系。

材　料　和　方　法

1實驗動物

28只10周齡雄性SHR，7只WKY大鼠，體重180～200 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SCXK(滬)2012-0002，合格證號為2007000552035。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只，室溫(22±2)℃，自然光照，相對濕度 60%～65%，自由飲水進食。

2藥物及試劑

芝麻素(純度≥98%)，上海純優(yōu)生物科技有限公司提供；卡托普利(captopril,Cap)片購于常州制藥廠有限公司；蘇木精、伊紅染液試劑盒由南京建成科技有限公司提供；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)抗體、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT， p-AKT)抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體均購于碧云天生物技術研究所；磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mTOR，p-mTOR)抗體由Santa Cruz提供；eIF-4E結(jié)合蛋白1(eIF-4E binding protein 1，4EBP-1)抗體、核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1)抗體購自上海生工生物股份有限公司；Bax抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

3主要方法

3.1動物分組給藥及舒張壓的測量SHR適應性喂養(yǎng)3周后，隨機分為模型(SHR)組、芝麻素低劑量(80 mg/kg)、高劑量(160 mg/kg)組及卡托普利(30 mg/kg)組，另有同周齡WKY大鼠作為正常對照組(WKY組)。給藥組用 0.5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑，按上述設定劑量灌胃給藥，模型組和正常對照組灌胃等體積 0.5%羧甲基纖維素鈉，每日1次，連續(xù)12周。分別于給藥前及給藥后每2周測1次血壓，用ALC-NIBP無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)，測量清醒靜息狀態(tài)下大鼠的尾動脈舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)。

3.2生化指標的檢測ELISA法測定各組大鼠尿的微量白蛋白(urinary microcontent of albumin，U-mAlb)；全自動生物化學分析儀測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)與血清肌酐(serum creatinine，SCr)含量；硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。具體方法和步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

3.3腎臟病理學觀察腎臟組織常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟水化等后，行HE和Masson染色，光鏡(×400)下觀察腎臟病理變化及膠原纖維增生情況。

3.4TUNEL法檢測腎組織的細胞凋亡率腎臟組織切片后，按照TUNEL試劑盒說明書方法檢測腎組織細胞凋亡。

3.5Western blot檢測AKT、p-AKT、mTOR、p- mTOR、4EBP1、S6K1、Bax、Bcl-2的蛋白水平RIPA裂解液(400 μL RIPA+4 μL PMSF)裂解腎臟組織提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，用 I 抗孵育，4 ℃過夜。洗滌液洗膜3次(每次10 min)，將膜浸入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG (1∶2 000)中，室溫孵育1 h，洗膜3次(每次10 min)，室溫ECL發(fā)光顯色、曝光、顯影、定影及分析(ImageJ 1.43分析軟件進行數(shù)據(jù)處理)，條帶強度用集成光密度值來表示，目的蛋白表達強度=目的蛋白集成密度值/β-actin集成密度值。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較，根據(jù)方差齊性檢驗，方差齊者采用SNK-q檢驗法，方差不齊者采用Tamhane’s T2檢驗法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1芝麻素對SHR尾動脈舒張壓的影響

與WKY組相比，SHR組大鼠血壓明顯升高(P<0.01)。與SHR組相比，在給藥后8周，Ses低、高劑量組及卡托普利組的舒張壓顯著下降。提示芝麻素具有降低SHR尾動脈舒張壓的作用，但降壓效果弱于卡托普利(P<0.05)，見表1。

表1　芝麻素對SHR尾動脈舒張壓的影響

Ses: sesamin; Cap: captopril.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△P<0.05,△△P<0.01vsCap.

2芝麻素對SHR腎功能的影響

與WKY組相比，SHR組大鼠的BUN、SCr、U-mAlb含量顯著升高(P<0.01)。與SHR組比較，Ses組及卡托普利組的BUN、SCr、U-mAlb水平明顯下降(P<0.05)。與卡托普利組相比，Ses低劑量組的BUN、U-mAlb指標水平明顯偏高(P<0.01)，高劑量組各指標與卡托普利組相比無顯著差異。提示芝麻素具有改善SHR腎損傷的作用，尤其高劑量組效果顯著，見圖1。

Figure 1.The effects of sesamin on the renal function in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

圖1芝麻素對SHR腎功能的影響

3芝麻素對SHR腎組織MDA含量和SOD活性的影響

與WKY組比較，SHR組大鼠的MDA含量顯著增加，SOD活性明顯降低(P<0.01)；與SHR組相比，Ses高劑量組的MDA含量明顯降低，SOD活性顯著提高(P<0.01)，但效果弱于卡托普利組(P<0.01)。提示芝麻素改善SHR腎損傷的作用與其抗氧化應激作用有關，見圖2。

4芝麻素對SHR腎組織形態(tài)學變化的影響

與WKY組比較，光鏡下HE染色顯示SHR組大鼠腎小球系膜細胞增生，腎小管上皮細胞出現(xiàn)萎縮，Masson染色顯示腎小球及腎小管周圍有較多藍染膠原纖維。而給予芝麻素、卡托普利治療后，腎小球系膜細胞未見明顯增生，腎小管上皮細胞較為完好，腎小球與腎小管藍染膠原纖維明顯減少。提示芝麻素對SHR腎組織病理損傷具有一定改善作用，見圖3、4。

5芝麻素對SHR腎組織細胞凋亡率的影響

WKY組幾乎無棕色顆粒細胞核的凋亡細胞。與WKY組相比，SHR組大鼠凋亡細胞明顯增多(P<0.01)；而給予芝麻素和卡托普利后，SHR組大鼠腎組織凋亡細胞顯著減少(P<0.01)。提示芝麻素具有抑制SHR腎組織細胞凋亡的作用，但作用弱于卡托普利(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The effects of sesamin on the renal content of MDA and activity of SOD in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

圖2芝麻素對SHR腎組織MDA含量和SOD活性的影響

Figure 3.The effects of sesamin on the pathological changes of the renal tissues in the SHR (HE staining, ×400).

圖3芝麻素對SHR腎組織病理學變化的影響

6芝麻素對SHR腎組織p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1蛋白水平的影響

各組總AKT和mTOR蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學顯著性。與WKY組相比，SHR組大鼠腎組織的AKT、mTOR蛋白磷酸化水平及4EBP1、S6K1蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與SHR組比較，芝麻素各劑量組及卡托普利組的p-AKT、p-mTOR、4EBP1、S6K1蛋白水平明顯下降(P<0.05)；而與卡托普利組相比，芝麻素高劑量組降低4EBP1蛋白表達水平的作用弱于前者(P<0.01)，對以上其余指標的影響差異無統(tǒng)計學顯著性。提示芝麻素可下調(diào)SHR腎組織AKT、mTOR蛋白磷酸化水平和4EBP1、S6K1蛋白表達水平，見圖6、7。

7芝麻素對SHR腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

SHR組大鼠腎組織的Bcl-2蛋白表達水平與WKY組相比明顯降低，Bax的蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2/Bax顯著下降(P<0.01)；與SHR組相比，芝麻素組和卡托普利組能明顯升高Bcl-2蛋白的表達，降低Bax蛋白的表達，增加Bcl-2/Bax比值(P<0.01)，且芝麻素低劑量組作用稍弱于卡托普利組(P<0.05)，而高劑量組作用與后者相當。提示芝麻素可通過上調(diào)SHR腎組織Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，抑制SHR腎組織細胞凋亡，見圖8。

Figure 4.The effect of sesamin on the collagen accumulation in the kidney of SHR (Masson, ×400).

圖4芝麻素對SHR腎組織膠原沉積的影響

Figure 5.The effect of sesamin on the apoptosis of renal tissue in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△P<0.05,△△P<0.01vsCap.

圖5芝麻素對SHR腎組織細胞凋亡率的影響

討　　論

高血壓腎損傷是由于長期高血壓病情發(fā)展引起腎內(nèi)小動脈、細小動脈發(fā)生病變，管腔逐漸硬化、狹窄，腎組織進行性缺血、萎縮，從而導致腎臟缺血性變化的一組臨床綜合征。作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，卡托普利已成功用于高血壓、心衰和腎臟疾病的治療。研究表明，它不僅能有效降低血壓、抗脂質(zhì)過氧化，而且能改善腎小球的血流動力學，降低腎小球基底膜的通透性，降低血肌酐，尿蛋白排泄，延緩腎小球硬化等[4]。本研究采用卡托普利為陽性對照藥，觀察芝麻素對SHR腎損傷的作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路之間的關系。

結(jié)果顯示，在12周內(nèi)，SHR組大鼠尾動脈舒張壓隨治療時間延長逐漸降低，尤其在第8周下降顯著，提示芝麻素具有降低SHR血壓的作用，但作用弱于卡托普利。U-mAlb為高血壓早期腎功能損害的常用檢測指標，SCr、BUN為中晚期腎功能改變的檢測指標。實驗結(jié)果顯示，SHR組大鼠U-mAlb、SCr、BUN含量均明顯增加，而芝麻素能顯著降低以上指標的含量，尤其高劑量組作用與卡托普利相當。其結(jié)果與我們以往報道一致[5]。HE和Masson染色結(jié)果顯示，SHR組伴有腎小球損傷，腎間質(zhì)纖維化及淋巴-單核細胞浸潤。而用藥后，芝麻素組腎臟病變有明顯改善，表明芝麻素可減輕SHR腎損傷，此結(jié)果與以往報道一致[3]。

研究表明，氧化應激是高血壓腎損害的重要發(fā)病機制之一，持續(xù)的高血壓狀態(tài)可致抗氧化活性顯著降低，氧化應激水平明顯增加，從而進一步導致腎組織結(jié)構的損害[6]。SOD是機體內(nèi)氧自由基清除酶體系的重要成員之一，MDA為反映機體抗脂質(zhì)過氧化潛在能力的重要參數(shù)，間接反映組織細胞過氧化損傷程度。實驗結(jié)果提示芝麻素改善自發(fā)性高血壓腎損傷的作用可能與其提高腎組織SOD水平，降低MDA含量，抑制氧化應激反應有關。

Figure 6.The effects of sesamin on the protein levels of p-AKT and p-mTOR in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;#P<0.05,##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

圖6芝麻素對SHR腎組織AKT 和mTOR蛋白磷酸化的影響

Figure 7.The effects of sesamin on the expressions of 4EBP1 and S6K1 proteins in SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

圖7芝麻素對SHR腎組織4EBP1和S6K1蛋白表達的影響

PI3K/AKT/mTOR信號通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的重要途徑之一，在細胞生長、增殖、代謝、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[7]。信號轉(zhuǎn)導分子PI3K下游有多種效應分子，AKT作為該通路的中心環(huán)節(jié)，負責由PI3K始動的生物信息的傳導，可作用于其下游的mTOR、核因子κB、糖原合成酶激酶3β、一氧化氮合酶、Bcl-2家族等多個靶點[8]。當機體內(nèi)各類生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)、能量等信號發(fā)生改變，AKT的蘇氨酸和絲氨酸殘基會發(fā)生磷酸化而進入胞質(zhì)和胞核，并通過結(jié)節(jié)性硬化復合體激活mTOR，促使其下游的S6K1與4EBP1發(fā)生磷酸化，進而調(diào)節(jié) mRNA 翻譯、蛋白質(zhì)合成及能量代謝等，在細胞增殖、分化及生長過程中發(fā)揮著關鍵調(diào)控作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芝麻素明顯降低SHR腎組織p-AKT、p-mTOR、4EBP1和S6K1的蛋白水平，其高劑量組作用與卡托普利相當。提示自發(fā)性高血壓大鼠腎臟損傷可能與其激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，p-AKT、p-mTOR、4EBP1及S6K1等過度活化有關，而芝麻素可有效抑制過度活化的PI3K/AKT/mTOR信號通路。

Figure 8.The effects of sesamin on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SHR. Mean±SD.n=7.**P<0.01vsWKY;##P<0.01vsSHR;△△P<0.01vsCap.

圖8芝麻素對SHR腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

另有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激可通過多種途徑誘導細胞凋亡[10]。TUNEL實驗結(jié)果提示芝麻素能有效抑制SHR腎組織細胞凋亡。Bcl-2家族作為PI3K/AKT/mTOR信號通路上的重要靶點之一，在細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用。Bcl-2家族中的核心成員為Bcl-2和Bax。Bcl-2可通過調(diào)控線粒體膜的完整性參與凋亡信號的調(diào)節(jié)，具有抑制細胞凋亡的作用，為凋亡的主要負調(diào)節(jié)因子。而Bax為Bcl-2活動的主要調(diào)節(jié)因子，具有抑制Bcl-2而促進細胞凋亡的作用。Bcl-2/Bax的表達情況決定細胞最終的命運，Bcl-2/Bax比值升高抑制細胞凋亡，比值降低則誘導細胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，芝麻素可明顯上調(diào)SHR腎組織抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax 表達，升高Bcl-2/Bax比值，且高劑量組作用與卡托普利無明顯差異。表明芝麻素減輕SHR腎損傷作用可能與其抑制細胞凋亡有關。

綜上所述，我們推測，芝麻素改善自發(fā)性高血壓大鼠腎臟損傷的作用機制可能與降低血壓、減少氧化應激反應、抑制過度激活的PI3K/AKT/mTOR信號通路及抑制細胞凋亡發(fā)生等作用有關，其深入的作用機制還有待于進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of sesamin on ameliorating kidney injury in spontaneously hypertensive rats and its relationship with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

HU Hao-ran, XUAN Jia-li, YANG Jie-ren, LI Wei, ZHAO Meng-qiu, HAN Jun

(DepartmentofPharmacology,PharmacologyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:aku110@ 163.com)

AIM: To study the effects of sesamin (Ses) on attenuating renal injury in spontaneously hypertensive rats (SHR) and its relationship with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.METHODS: Spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 4 groups: model (SHR) group, Ses low-dose (80 mg/kg) group, Ses high-dose (160 mg/kg) group and captopril (30 mg/kg) group. Another 7 WKY rats were given 0.5% sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na, the solvent was used to dissolve the drugs) as control group. Meanwhile, the rats in drug treatment groups were given the corresponding drugs. All animals were administered intragastrically once a day, and the blood pressure was measured every 2 weeks before and after the beginning of the administration. After 12 weeks, blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr), urine micro-albumin (U-mAlb), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were measured. The pathological changes of the renal tissues were observed under microscope with HE and Masson staining. Apoptotic rate of nephridial tissue was determined by TUNEL method. The protein levels of p-AKT, p-mTOR, 4EBP1, S6K1, Bcl-2 and Bax were detected by Western blot. RESULTS: Ses decreased the diastolic blood pressure of SHR, significantly ameliorated the pathological damage in the nephridial tissues. Compared with model group, Ses was obviously reduced the contents of SCr, BUN, U-mAlb, MDA and apoptotic rate of the kidney, decreased the protein levels of p-AKT, p-mTOR, 4EBP1, S6K1 and Bax, and increased the protein expression of Bcl-2 and SOD activity. CONCLUSION: The protective effects of Ses against renal injury in SHR may be related to decreasing blood pressure, increasing anti-oxidative stress, restraining apoptosis and inhibiting over-activated PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

Sesamin; Spontaneously hypertensive rats; PI3K/AKT/mTOR signaling pathway; Bax; Bcl-2

1000- 4718(2016)04- 0719- 07

2015- 09- 25

2016- 03- 09

安徽省教育廳自然科學基金重點項目(No.KJ2015A157); 安徽省教育廳自然科學基金一般項目(No.kj2011B200)

Tel： 0553-3932607； E-mail: aku110@163.com

R544.1; R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.023

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