鐘金男，　蘭　蘭，　何光珍，　黃　革，　楊　炯，　高亞東

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430071)

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·短篇論著·

鈣庫操縱性鈣通道在人循環(huán)纖維細(xì)胞中的表達(dá)及功能*

鐘金男，蘭蘭，何光珍，黃革，楊炯，高亞東△

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430071)

目的： 研究鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels，SOCC)相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2在人循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocytes)中的表達(dá)及SOCC對人循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響。方法: 采集健康人外周靜脈血，分離出單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)分化為循環(huán)纖維細(xì)胞。采用RT-PCR和real-time PCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達(dá)情況，并檢測SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響。結(jié)果: Real-time PCR 檢測結(jié)果顯示ORAI1-3和STIM1-2 mRNA在循環(huán)纖維細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平，并且SOCC抑制劑 SKF-96365對循環(huán)纖維細(xì)胞分化具有明顯的抑制作用。結(jié)論: SOCC表達(dá)于循環(huán)纖維細(xì)胞中，并且影響循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。

循環(huán)纖維細(xì)胞； 鈣庫操縱性鈣通道； ORAI1-3； STIM1-2

人循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocytes)是外周循環(huán)中的一種骨髓來源的間充質(zhì)祖細(xì)胞[1]，由CD14+單核細(xì)胞分化而來[2]，主要參與組織的修復(fù)與纖維化的過程，除此之外，還能作為抗原遞呈細(xì)胞激活 T 淋巴細(xì)胞[3]、促進(jìn)血管生成[4]和穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)[5]。在健康個(gè)體中，它占有核細(xì)胞的比例不到1%[6]。近年來，大量研究證實(shí)循環(huán)纖維細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的前體[7]，能夠遷移并在肺中募集，可能通過促進(jìn)平滑肌層增厚[8]、促纖維化和/或促進(jìn)炎癥過程[3]、促進(jìn)新血管生成[4]和重建細(xì)胞外基質(zhì)[5]等途徑參與慢性哮喘氣道重塑過程。

鈣信號是細(xì)胞的重要第二信使，參與了細(xì)胞的增殖、分化、遷移和細(xì)胞因子分泌等多種功能的調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)等鈣庫中的內(nèi)鈣釋放和胞外鈣離子內(nèi)流兩種途徑實(shí)現(xiàn)[9]。細(xì)胞膜上鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel, SOCC)介導(dǎo)的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry，SOCE)是非興奮性細(xì)胞外鈣內(nèi)流的主要途徑[10]。

目前發(fā)現(xiàn)ORAI家族蛋白ORAI1-3主要參與SOCC的鈣內(nèi)流孔道的構(gòu)成，而STIM家族蛋白STIM1-2 主要作為胞內(nèi)鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時(shí)將這一信號傳遞到胞膜的 SOCC，促使其開放，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流。本研究應(yīng)用real-time PCR檢測了體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細(xì)胞中SOCC相關(guān)功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2表達(dá)情況，并初步探討SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化成熟的影響，為將來深入探討它們在支氣管哮喘病理機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基、1 mmol/L HEPES、100×非必須氨基酸、100 mmol/L丙酮酸鈉和100× ITS-3均購自Sigma；青霉素(1×107U/L)/鏈霉素(10 g/L)混合液(100×)和200 mmol/L谷氨酰胺購自HyClone；平底 24孔組織培養(yǎng)板購自BD Biosciences；人CD14+單核細(xì)胞負(fù)選磁珠購自 Dynal Biotech；TRITC連接的鼠抗人CD45 和 I型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)抗體、驢抗兔 IgG H&L(FITC)II 抗及 SKF-96365 購自Abcam；TRIzol、DNA處理酶I 和逆轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ購自Invitrogen；高保真 Taq酶和 SYBR?Premix Ex TaqTM購自 TaKaRa。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

2主要方法

2.1人循環(huán)纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)用肝素抗凝管采集每位健康志愿者(來自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，均簽署書面知情同意書)外周血50 mL, 用pH 7.4 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積稀釋后, 用等體積的淋巴細(xì)胞分離液分離, 2 000 r/min離心 20 min，小心吸取白膜。用至少3倍體積的無菌 PBS 洗滌白膜，1 500 r/min離心15 min，輕輕吸除上清。分離所得的細(xì)胞即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(periphral blood mononuclear cells,PBMCs)。加500 μL 隔離緩沖液(0.1% BSA 和2 mmol/L EDTA 的無Ca2+及Mg2+的PBS)輕輕混勻細(xì)胞，用Dynabeads?UntouchedTM人單核細(xì)胞磁珠負(fù)選試劑盒得CD14+單核細(xì)胞。用無血清的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基[含10 mmol/L HEPES，2 mmol/L谷氨酰胺，1×105U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素， 0.2% BSA，1× ITS-3(5 mg/L胰島素，5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白，5 μg/L亞硒酸鈉)，1 mmol/L 丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸] 1 mL 重懸細(xì)胞，吹打混勻。將所得的細(xì)胞按2.5×109/L的密度接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL，然后將培養(yǎng)板置于含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2人循環(huán)纖維細(xì)胞的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定：按上述方法培養(yǎng)7 d后，光鏡下觀察，呈紡錘狀的長梭形貼壁細(xì)胞即為循環(huán)纖維細(xì)胞。(2)免疫組織化學(xué)鑒定：將分離的細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃，含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 7 d，然后選擇分化較好的細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基， PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，加入TRITC 連接的 CD45 抗體，4 ℃孵育 30 min 后，細(xì)胞清洗 3 次。用 250 μL 的固定破膜劑重懸細(xì)胞，4 ℃固定破膜 20 min。加入 PBS 溶液 2 mL，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，洗滌細(xì)胞 3 次，用含 2% 牛血清白蛋白的 PBS 室溫封閉60 min。加 Col Ⅰ的I抗，4 ℃過夜。再用 2 mL PBS 清洗細(xì)胞3 次后，加入 FITC 標(biāo)記的驢抗兔IgG的II抗，4 ℃暗室孵育，過夜。 2 mL PBS清洗細(xì)胞 3 次后，加入 PBS ，熒光顯微鏡下觀察CD45和Col I的表達(dá)情況。

2.3RT-PCR及Real-time PCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表達(dá)情況將分離得到的CD14+單核細(xì)胞按 2.5×108/L 的密度接種到24 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d。取樣后每管加入1 mL TRIzol進(jìn)行RNA 抽提，最后每管RNA 晾干后加40 μL滅菌0.1‰ DEPC 處理雙蒸水溶解RNA 沉淀。取2 μg 總RNA 至1.5 mL 離心管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所使用DNase I 和逆轉(zhuǎn)錄酶SS Ⅲ均來自Invitrogen ，反轉(zhuǎn)錄完成后生產(chǎn)的cDNA 產(chǎn)物補(bǔ)雙蒸水至50 μL。RT-PCR 檢測采用的反應(yīng)體系為：0.4 μL primer F/R(10 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2 μL 10倍緩沖液，0.2 μL Ex Taq，2 μL反轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物為模板，最后補(bǔ)滅菌雙蒸水至20 μL；反應(yīng)條件為：為94 °C 5 min；94 °C 15 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，共28循環(huán)；72 °C 5 min。反應(yīng)完成后PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。Real-time PCR 檢測基因表達(dá)量采用的反應(yīng)體系是10 μL SYBR?Premix Ex TaqTM，0.4 μL primer F/R(10 μmol/L)，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(10 μmol/L)，2 μL 反轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物，最后補(bǔ)滅菌雙蒸水至20 μL。Real-time PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 °C 10 s；94 °C 5 s，60 °C 38 s，40 循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。RT-PCR 以及real-time PCR 所用引物見表1。

2.4SOCC抑制劑對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響將分離得到的 PBMCs 按 2.5×108/L 的密度接種到24孔板內(nèi)；分組情況如下：分別設(shè)置空白對照組和SOCC抑制劑 SKF-96365 干預(yù)組：選擇 1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L 和 100 μmol/L 多個(gè)濃度梯度；37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，然后于 10 倍光學(xué)顯微鏡下觀察循環(huán)纖維細(xì)胞分化的情況，隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

表1RT-PCR 以及real-time PCR所用引物序列

Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR and real-time PCR

NamePrimersequence(5'-3')Product(bp)GAPDHF:CATCACCATCTTCCAG-GAGCGA343R:GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-GGhORAI1F:AATCTCAACTCGGTCAAG-GAGTC343R:ACTGTCGGTCAGTCTTATG-GCTAhORAI2F:CGCAGTACCAGTACCCGCG-GCCG327R:AGCCCGTGTGACTC-CCAGGGCCAhORAI3F:GCGAGCAGGCCCCGCTGAAC348R:CTTCAATGTGGGGCAGCAGA-CAChSTIM1F:GTTTGCCTATATCCAGAAC-CGTTA342R:TACCATGAGCTGTGAGAT-TCTAGChSTIM2F:AGATGGTGGAATTGAAG-TAGAGG344R:CTTGAGCTGAAGTTTTT-GTCTGTG

F: forward; R: reverse.

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均在Excel中完成分析，數(shù)值計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1循環(huán)纖維細(xì)胞的鑒定

將分離所得 PBMCs 用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，光鏡下可見部分貼壁細(xì)胞分化為長梭形，形態(tài)上符合已分化的循環(huán)纖維細(xì)胞的特征(圖1)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]；免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞分子標(biāo)記的表達(dá)情況，冰丙酮固定細(xì)胞并破膜后，用 TRITC 連接的 CD45 抗體和 FITC 連接的 Col I 抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)生物素親和素的信號放大作用，熒光顯微鏡下可同時(shí)觀察到 TRITC 的紅色熒光和 FITC 的綠色熒光，證實(shí)梭形細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)CD45和Col I分子(圖2)。

Figure 1.Morphological characteristics of human circulating fibrocytes. PBMCs were cultured in serum-free medium for 7 d (×200). Typical fibrocytes were spindle-shaped (black arrow); some round adherent cells with big nucleus were macrophages differentiated from PBMCs (red arrow); small round suspended cells were lymphocytes (blue arrow).

圖1循環(huán)纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

2RT-PCR和real-time PCR 檢測循環(huán)纖維細(xì)胞中ORAI1-3和STIM1-2的mRNA表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示各基因引物特異性良好，條帶特異且PCR 產(chǎn)物大小符合預(yù)期，同時(shí)也表明了這批引物能夠用于real-time PCR 檢測，凝膠電泳檢測結(jié)果見圖3。進(jìn)一步使用這些引物我們在6 個(gè)志愿者的人體循環(huán)纖維細(xì)胞中對ORAI1、 ORAI2、ORAI3、STIM1和STIM2進(jìn)行了real-time PCR 的檢測。結(jié)果顯示，ORAI1 mRNA的表達(dá)量明顯高于ORAI2和ORAI3；而STIM1 mRNA的表達(dá)量也高于STIM2，表明ORAI1和STIM1是循環(huán)纖維細(xì)胞SOCC的主要構(gòu)成和調(diào)節(jié)分子,見圖4。

Figure 2.The molecular markers of human circulating fibrocytes. The results of immunohistochemical detection of the molecular markers expressed in the fibrocytes were shown.

圖2循環(huán)纖維細(xì)胞的分子標(biāo)記

Figure 3.The mRNA expression of SOCC-related proteins in human circulating fibrocytes detected by RT-PCR.

圖3RT-PCR檢測循環(huán)纖維細(xì)胞SOCC相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)

Figure 4.The mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 in human circulating fibrocytes detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsORAI1;#P<0.05vsSTIM1.

圖4Real-time PCR檢測ORAI1-3 和STIM1-2的mRNA 在人循環(huán)纖維細(xì)胞組織中的表達(dá)譜及表達(dá)豐度

3SOCC抑制劑SKF-96365對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響

SKF-96365 是 SOCC的非特異性抑制劑，研究表明在SKF濃度為10 μmol/L時(shí)，基本上對細(xì)胞無毒害作用[12]。如圖 5 所示，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PBMCs在加入較低濃度(1 μmol/L和3 μmol/L)的SKF-96365時(shí)，循環(huán)纖維細(xì)胞的分化過程即受到明顯的抑制，且具有很強(qiáng)的濃度依賴性，即濃度越高抑制越明顯。當(dāng) SKF-96365 的濃度為10 μmol/L 時(shí)，能抑制大部分循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。

Figure 5.SOCC inhibitor SKF-96365 inhibited the differentiation of human circulating fibrocytes. SKF-96365 at diffe-rent concentrations was added into culured PBMCs. Numbers of cells in 5 randomly selected fields were counted. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖5SOCC抑制劑 SKF-96365 對循環(huán)纖維細(xì)胞分化的影響

討　　論

氣道重塑是慢性哮喘的重要特征，其病理改變包括氣道上皮下纖維化及肌成纖維細(xì)胞聚積[13]。許多研究都表明循環(huán)纖維細(xì)胞是參與哮喘結(jié)構(gòu)和功能損害的重要因素。最早在2003 年Schmidt 等[14]發(fā)現(xiàn)在哮喘患者的氣道中含有循環(huán)纖維細(xì)胞(CD45+/CD34+和Col I 為識別標(biāo)記)，而且這些細(xì)胞隨著患者接觸過敏原增多而數(shù)量增多。一項(xiàng)獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重難治性哮喘患者的支氣管活檢樣本中支氣管壁中循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯升高，而外周血中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量也明顯升高[8]。最近一項(xiàng)臨床研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者外周血中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可以作為臨床嚴(yán)重哮喘的生物學(xué)標(biāo)志[15]。

SOCC是非興奮性細(xì)胞胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道，參與了基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應(yīng)激等多種生理和病理生理過程。有研究表明ORAI1和STIM1兩種蛋白是構(gòu)成SOCE 通道的重要組成部分。ORAI是近年來發(fā)現(xiàn)的一種位于細(xì)胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動(dòng)物ORAI家族中有3 個(gè)成員：ORAI1、ORAI2和ORAI3，其中ORAI1是最重要的SOCE 的效應(yīng)蛋白。研究表明ORAI1可以和ORAI2、ORAI3復(fù)合體來介導(dǎo)SOCE[16]。STIM家族成員包括STIM1和STIM2 。在哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)STIM1是SOCC的重要調(diào)節(jié)分子，而STIM2主要與維持鈣庫的穩(wěn)定有關(guān)。STIM1是分子量為77 kD 的跨膜蛋白，主要位于ER 膜上,它具有感受鈣池充盈狀態(tài)并將感受信號通過不同蛋白作用機(jī)制傳遞給ORAI及TRPC通道的雙重功能，是共同介導(dǎo)SOCE 的關(guān)鍵分子[17]。我們的 mRNA 表達(dá)研究表明，體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞均表達(dá)這些 SOCC相關(guān)蛋白，其中以STIM1和ORAI1的表達(dá)最為豐富，提示STIM1和ORAI1是循環(huán)纖維細(xì)胞 SOCC的主要構(gòu)成分子和調(diào)節(jié)分子。

單核細(xì)胞是循環(huán)纖維細(xì)胞的前體，SOCC介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流參與單核細(xì)胞的激活、增殖、分化及細(xì)胞因子的分泌等多種生理過程[18]。我們的既往研究顯示，在單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[12,19]，SOCC發(fā)揮了重要功能，對樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原遞呈等功能具有調(diào)節(jié)作用，并有可能參與哮喘氣道炎癥過程。循環(huán)纖維細(xì)胞同樣由單核細(xì)胞分化而來，因此，理論上SOCC同樣會(huì)發(fā)揮功能調(diào)控作用。我們的研究結(jié)果證實(shí)了SOCC調(diào)控循環(huán)纖維細(xì)胞的分化過程。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞可由循環(huán)纖維細(xì)胞分化而來，其基因表達(dá)和炎癥介質(zhì)釋放等多種細(xì)胞功能調(diào)控與非選擇性的 SOCC密切相關(guān)[20-21]。因此，循環(huán)纖維細(xì)胞的分化以及其進(jìn)一步的分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過程均受到SOCC的影響，提示SOCC可以作為一個(gè)節(jié)點(diǎn)分子，調(diào)節(jié)循環(huán)纖維細(xì)胞參與的病理生理過程，比如慢性哮喘的氣道重塑過程。下一步我們將用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SOCC抑制后對循環(huán)纖維細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中的作用的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示循環(huán)纖維細(xì)胞表達(dá)SOCC相關(guān)基因，并且SOCC的活性影響循環(huán)纖維細(xì)胞的分化，表明SOCC是循環(huán)纖維細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

[1]Bucala R, Spiegel LA, Chesney J, et al. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair [J]. Mol Med, 1994, 1(1):71-81.

[2]Yang L, Scott PG, Giuffre J, et al. Peripheral blood fibrocytes from burn patients: identification and quantification of fibrocytes in adherent cells cultured from peripheral blood mononuclear cells[J]. Lab Invest, 2002, 82(9):1183-1192.

[3]Chesney J, Bacher M, Bender A, et al. The peripheral blood fibrocyte is a potent antigen-presenting cell capable of priming naive T cellsinsitu[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(12):6307-6312.

[4]Hartlapp I, Abe R, Saeed RW, et al. Fibrocytes induce an angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and promote angiogenesisinvivo[J]. FASEB J, 2001, 15(12):2215-2224.

[5]Bianchetti L, Barczyk M, Cardoso J, el al. Extracellular matrix remodelling properties of human fibrocytes[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(3):483-495.

[6]Quan TE, Cowper S, Wu SP, et al. Circulating fibrocytes: collagen-secreting cells of the peripheral blood [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(4):598-606.

[7]Isgro M, Bianchetti L, Marini MA, el al. The C-C motif chemokine ligands CCL5, CCL11, and CCL24 induce the migration of circulating fibrocytes from patients with severe asthma[J].Mucosal Immunol, 2013, 6(4):718-727.

[8]Lo CY, Michaeloudes C, Bhavsar PK, et al. Increased phenotypic differentiation and reduced corticosteroid sensitivity of fibrocytes in severe asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2015, 135(5):1186-1195.

[9]Parekh AB, Putney JW. Store-operated calcium channels[J]. Physiol Rev, 2005, 85(2):757-810.

[10]Cheng KT, Ong HL, Liu X, et al. Contribution of TRPC1 and Orai1 to Ca2+entry activated by store depletion[J]. Adv Exp Med Biol, 2011, 704:435-449.

[11]Ekert JE, Murray LA, Das AM, et al. Chemokine (CC motif) ligand 2 mediates direct and indirect fibrotic responses in human and murine cultured fibrocytes[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2011, 4(1):1-10.

[12]Geng S, Gao Y, Yang J, et al. Potential role of store-operated Ca2+entry in Th2 response induced by histamine in human monocyte-derived dendritic cells[J]. Int Immunopharmacol, 2012, 12(2): 358-367.

[13]Nelson HS, Davies DE, Wicks J, et al. Airway remodeling in asthma: new insights[J]. J Allergy Clin Immunol, 2003, 111(2):215-225.

[14]Schmidt M, Sun G, Stacey MA, et al. Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma[J]. J Immunol, 2003, 171(1): 380-389.

[15]Shipe R, Burdick MD, Strieter BA, et al. Number, activation, and differentiation of circulating fibrocytes correlate with asthma severity[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016,137(3):750-757.e3.

[16]Vig M, Peinelt C, Beck A, et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+entry[J]. Science, 2006, 312(5777):1220-1223.

[17]Zhang SL, Yu Y, Roos J, et al. STIM1 is a Ca2+sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+store to the plasma membrane[J]. Nature, 2005, 437(7060):902-905.

[18]Aires V, Hichami A, Filomenko R, et al. Docosahexaenoic acid induces increases in [Ca2+]ivia inositol 1, 4, 5-triphosphate production and activates protein kinase Cγ and -δ via phosphatidylserine binding site: implication in apoptosis in U937 cells[J]. Mol Pharmacol, 2007, 72(6):1545-1556.

[19]Gao YD, Hanley PJ, Rinné S, et al. Calcium-activated K+channel (KCa3.1) activity during Ca2+store depletion and store-operated Ca2+entry in human macrophages [J]. Cell Calcium， 2010, 48(1):19-27.

[20]Ikeda K, Nakajima T, Yamamoto Y, et al. Roles of transient receptor potential canonical (TRPC) channels and reverse-mode Na+/Ca2+exchanger on cell proliferation in human cardiac fibroblasts: Effects of transforming growth factor β1[J]. Cell Calcium, 2013, 54(3):213-225.

[21]Kurahara LH, Sumiyoshi M, Aoyagi K, et al. Intestinal myofibroblast TRPC6 channel may contribute to stenotic fibrosis in Crohn′s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2015, 21(3):496-506.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and function of store-operated calcium channels in human circulating fibrocytes

ZHONG Jin-nan, LAN Lan, HE Guang-zhen, HUANG Ge, YANG Jiong, GAO Ya-dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China.E-mail:gaoyadong@whu.edu.cn)

AIM: To investigate the expression and function of store-operated calcium channels (SOCC) in human circulating fibrocytes.METHODS: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and cultured in serum-free media. After 7 d, the PBMCs differentiated into fibrocytes. RT-PCR and real-time PCR were performed to determine the mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 in the fibrocytes. SOCC inhibitor SKF-96365 was used to elucidate the role of SOCC in the differentiation of fibrocytes. RESULTS: The results of real-time PCR showed that the mRNA expression of ORAI1-3 and STIM1-2 was positive in cultured fibrocytes. SKF-96365 (10 μmol/L) significantly inhibited the differentiation of fibrocytes.CONCLUSION: SOCC-related proteins ORAI1-3 and STIM1-2 are abundantly expressed in the fibrocytes, and may play an important role in the differentiation of these cells.

Circulating fibrocytes; Store-operated calcium channels; ORAI1-3; STIM1-2

1000- 4718(2016)04- 0733- 06

2015- 09- 29

2016- 03- 14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270069)

Tel: 027-67813277； E-mail: gaoyadong@whu.edu.cn

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.025

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