徐志偉，　王文棟，　常曉彤

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院生化教研室，河北 張家口 075000)

?

胰島素抵抗小鼠血清微小RNA的芯片及信息學(xué)分析*

徐志偉，王文棟，常曉彤△

(河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院生化教研室，河北 張家口 075000)

目的： 探討胰島素抵抗小鼠血清水平微小RNA(microRNAs)變化圖譜及相關(guān)microRNAs的可能作用機(jī)制。方法: 以高脂飼料喂養(yǎng)昆明小鼠，制備胰島素抵抗模型；以微陣列芯片技術(shù)分析胰島素抵抗小鼠及正常小鼠血清水平microRNAs變化圖譜并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證；以miRanda數(shù)據(jù)庫對(duì)差異microRNAs進(jìn)行靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)；以miRBase數(shù)據(jù)庫獲得與胰島素抵抗相關(guān)的microRNAs序列；基于microRNAs序列，應(yīng)用STRING在線分析工具(http://string.embl.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。結(jié)果: 胰島素抵抗小鼠血清中miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a、miR-199a、miR-127、miR-184、miR-30e、miR-134、miR-195、miR-206、miR-429、miR-212、miR-362、miR-382、miR-154和miR-466h表達(dá)顯著上調(diào)，miR-211、miR-504、miR-877和miR-1930顯著下調(diào)。與胰島素抵抗密切相關(guān)的miR-143可以結(jié)合脂肪量及肥胖相關(guān)蛋白(FTO)的3’-UTR，并且FTO與Rpgrip1l、Tmem18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和 Thada相互作用。結(jié)論: 在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs相比正常小鼠出現(xiàn)了顯著變化，表達(dá)顯著上調(diào)的有17個(gè)。應(yīng)用在線分析工具發(fā)現(xiàn)與胰島素抵抗密切相關(guān)的miR-143可以調(diào)節(jié)FTO蛋白表達(dá)，并且FTO與另外10種與糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白相互作用，這將有助于對(duì)胰島素抵抗機(jī)制的全面了解。

胰島素抵抗； 微小RNA； 芯片； 信息學(xué)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是機(jī)體靶組織對(duì)胰島素反應(yīng)低下的一種病理狀態(tài)，它與高胰島素血癥、糖耐量異常、脂代謝紊亂、高血壓和冠心病等疾病相關(guān)，是這些疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。編碼胰島素級(jí)聯(lián)信號(hào)中相關(guān)蛋白的基因多態(tài)性、基因失調(diào)、轉(zhuǎn)錄后修飾及相關(guān)蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)參與了IR的發(fā)生[1]。

微小RNA(microRNAs)作為一類廣泛參與多種生理及病理過程的小分子非編碼RNA，通過結(jié)合mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白的合成，是基因表達(dá)調(diào)控的重要成分，其顯著特點(diǎn)是具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。研究顯示，microRNAs與IR的發(fā)生密切相關(guān)，一些小組對(duì)胰島素作用的主要靶組織如肝臟、骨骼肌和脂肪組織中microRNAs變化圖譜進(jìn)行了廣泛研究。Gallagher等[2]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者骨骼肌中有11個(gè)microRNAs異常表達(dá);Ling等[3]在IR的3T3-L1脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平降低50%以上的microRNAs共29個(gè)。

2008年以來，一系列研究報(bào)告了血漿或血清中microRNAs的穩(wěn)定存在，并且表明，血漿或血清中microRNAs改變可以反映機(jī)體組織的生理或病理性改變[4]。多項(xiàng)研究均顯示了2型糖尿病患者血清或血漿microRNAs譜顯著不同于健康對(duì)照組[5-7]。但是，這些文獻(xiàn)沒有明確2型糖尿病患者是胰島素抵抗還是胰島功能低下，患病時(shí)間多長(zhǎng)，也無法排除潛在的并發(fā)癥。為此，我們以高脂喂食的小鼠胰島素抵抗模型為研究對(duì)象，用微陣列芯片法分析了單純胰島素抵抗的小鼠血清microRNAs變化圖譜，并對(duì)顯著改變的microRNAs進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

材　料　和　方　法

1動(dòng)物和主要試劑

健康4周齡雄性昆明小鼠，體重(20±2)g，由首都醫(yī)科大學(xué)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京2014-0004)。

葡萄糖測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；胰島素ELISA測(cè)定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)； RNeasy Mini Kit、RNase-free DNase I、miScript Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒和mi-Script SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)； Flash-Tag? Biotin HSR RNA Labeling Kit、GeneChip WT Terminal Labeling Kit and Control Kit 和GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit(Affymetrix)。

2方法

2.1胰島素抵抗小鼠模型的建立實(shí)驗(yàn)小鼠以高脂飼料(每100 g基礎(chǔ)飼料加入奶粉10 g，豬油10 g，白糖10 g，雞蛋1/3個(gè)，新鮮黃豆芽250 g)飼養(yǎng)3月后，按穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，以HOMA-IR>2.15的小鼠為胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[8]。以正常飼料喂養(yǎng)3個(gè)月的小鼠(n=10)作為正常對(duì)照小鼠，與胰島素抵抗模型小鼠(n=10)分別采集血清，進(jìn)行microRNAs的芯片和信息學(xué)分析。

2.2血液收集及空腹血糖和血清胰島素水平的測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組小鼠空腹8 h后， 斷尾法采集小鼠尾血，離心(1 088×g/min，5 min)制備血清，用于血糖測(cè)定或-80 ℃保存用于胰島素測(cè)定及microRNAs分析。血糖測(cè)定用葡萄糖氧化酶法試劑盒，20 μL血清加3 mL 酶酚混合試劑，37 ℃保溫15 min, 以722分光光度計(jì)在505 nm處測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算血糖濃度。胰島素測(cè)定采用小鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行，分別在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔加樣50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌拍干后，加入酶標(biāo)液50 μL，空白孔除外，37 ℃溫育30 min，洗滌拍干。每孔加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度。

2.3采用Turner的穩(wěn)態(tài)模型(HOMA-IR)[9]評(píng)價(jià)胰島素抵抗HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹血清水平胰島素(mIU/L)/22.5。

2.4血清microRNAs 芯片分析血清樣本送北京康普森生物技術(shù)有限公司對(duì)血清中microRNA進(jìn)行芯片分析。(1)采用TRIzol法提取血清水平總RNA，并進(jìn)一步對(duì)總RNA 進(jìn)行過柱純化；(2)微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，1.5% 的甲醛變性凝膠檢測(cè)總RNA完整性；(3)Poly(A)加尾； (4)Flash Tag Biotin HSR 連接；(5)生物素標(biāo)記；(6)芯片雜交(芯片規(guī)格為Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 Array)；(7)芯片洗脫和掃描(GeneChip Scanner 3000 7G)；(8)應(yīng)用GCOS 1.4軟件及miRNAQC tool進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果針對(duì)芯片結(jié)果中顯著上調(diào)的mmu-miR-143和顯著下調(diào)的mmu-miR-877，應(yīng)用miScript Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，37 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min, 應(yīng)用miScript SYBR Green PCR 試劑盒在7300定量PCR儀(Applied Biosystem)檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有反應(yīng)重復(fù)3次。以Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。miR-30a的上游引物序列為5’-AGCCGTGTAAACATCCTCGAC-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-125的上游引物序列為5’-AGCGTCCCTGAGACCCTTTA-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-126的上游引物序列為5’-AGCGGGCATTATTACTTTTGGT-3’， 下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’； miR-143的上游引物序列為5’-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3’, 下游引物序列為5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；miR-199a的上游引物序列為5’-AGCACCCAGTGTTCAGACTACCT-3’，下游引物序列為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-877的上游引物序列為5’-ACCGTAGAGGAGATGGCG-3’, 下游引物序列為5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；以U6作為內(nèi)參照，其上游引物序列為5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’， 下游引物序列為5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。按照公式2-ΔΔCt計(jì)算microRNAs相對(duì)表達(dá)量。

2.6相關(guān)microRNAs的生物信息學(xué)分析應(yīng)用miRanda(http://www.microrna.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)差異microRNAs進(jìn)行靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)，選取每條 microRNA 相對(duì)的3′-UTR中排名前10位的基因作為候選靶點(diǎn)基因[10]，利用miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)獲得相關(guān)microRNAs序列[11]。應(yīng)用STRING在線分析工具(http://string.embl.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系[12]。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用微陣列數(shù)據(jù)顯著差異分析軟件(Significance Analysis of Microarray, SAM；http://www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)配對(duì)分析兩種組織間的microRNAs 表達(dá)差異, 中位假基因檢出率(false disco-very rate, FDR)<0.05為有顯著差異。

結(jié)　　果

1正常和胰島素抵抗小鼠血清水平microRNAs 差異分析

芯片分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照小鼠相比，胰島素抵抗小鼠血清水平有21個(gè)microRNAs 表達(dá)呈顯著差異，其中表達(dá)顯著上調(diào)者17個(gè)(表1)，顯著下調(diào)者4個(gè)(表2)。

表1胰島素抵抗小鼠血清中表達(dá)顯著上調(diào)的microRNAs

Table 1.Significantly up-regulated microRNAs in the serum of mice with insulin resistance (IR)

MicroRNAsExpressionquantityinIRmice Expressionquantityinnormalmicemmu-miR-466h4.085642.04419mmu-miR-30a3.671671.50237mmu-miR-1268.011443.92011mmu-miR-125a8.089223.67056mmu-miR-1438.648684.16767mmu-miR-1543.749911.35067mmu-miR-3824.576512.02187mmu-miR-3624.183501.46703mmu-miR-2124.551091.70931mmu-miR-4293.938741.04031mmu-miR-2066.085743.09831mmu-miR-1956.070512.94784mmu-miR-1346.255083.06701mmu-miR-30e7.382293.65052mmu-miR-1845.801861.41851mmu-miR-1277.203372.78526mmu-miR-199a6.992972.56691

表2胰島素抵抗小鼠血清中表達(dá)顯著下調(diào)的microRNAs

Table 2.Significantly down-regulated microRNAs in the serum of mice with insulin resistance (IR)

MicroRNAsExpressionquantityinIRmice Expressionquantityinnormalmicemmu-miR-5043.232687.33194mmu-miR-8772.894666.17390mmu-miR-19301.458993.68222mmu-miR-2114.434519.54351

2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)與胰島素抵抗相關(guān)的血清水平miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143、miR-199a及miR-877進(jìn)行驗(yàn)證。胰島素抵抗組miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143和miR-199a的相對(duì)表達(dá)量分別為2.57±0.46、2.18±0.40、2.22±0.51、2.78±0.43和2.82±0.58，與健康組相比均顯著上調(diào);miR-877的相對(duì)表達(dá)量為0.42±0.08，與健康組相比顯著下調(diào)。各種microRNAs實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，見圖1。

Figure 1.Real-time PCR results of miR-30a, miR-125, miR-126, miR-143, miR-199a and miR-877 expression in the serum of mice.IR: insulin resistance. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal (N).

圖1小鼠血清miR-30a、miR-125、miR-126、miR-143、miR-199a、miR-877表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

3相關(guān)靶點(diǎn)基因預(yù)測(cè)

采用miRanda數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果見表3。由于目前已經(jīng)確定的microRNAs靶基因數(shù)量有限，mmu-miR-126、mmu-miR-125a、mmu-miR-127、mmu-miR-199a和mmu-miR-362 未預(yù)測(cè)到其靶基因。

4MicroRNAs序列

應(yīng)用miRBase數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)microRNAs序列，見表4。

5MicroRNAs調(diào)節(jié)蛋白及蛋白相互作用的預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線分析工具STRING發(fā)現(xiàn)miR-143可以結(jié)合脂肪量及肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)的3’-UTR，F(xiàn)TO是一個(gè)與脂肪量和肥胖相關(guān)的酶[13]，它與另外10個(gè)蛋白R(shí)pgrip1l、Tmem18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和Thada相關(guān)，這些蛋白增加了糖尿病發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。以FTO為中心預(yù)測(cè)的這些蛋白的相互作用關(guān)系見圖2。

表3　差異表達(dá)microRNAs的主要靶基因

表4血清胰島素抵抗相關(guān)microRNAs的序列

Table 4.Sequences of serum microRNAs associated with insulin resistance

MicroRNAsSequences(5’-3’)mmu-miR-466hUGUGUGCAUGUGCUUGUGUGUAmmu-miR-30aUGUAAACAUCCUCGACUGGAAGmmu-miR-126CAUUAUUACUUUUGGUACGCGmmu-miR-125aUCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAmmu-miR-143GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUmmu-miR-154AAUCAUACACGGUUGACCUAUUmmu-miR-382AAGUUGUUCGUGGUGGAUUCGmmu-miR-362AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGUmmu-miR-212ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACUmmu-miR-429UAAUACUGUCUGGUAAAACCGUmmu-miR-206UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGmmu-miR-195UAGCAGCACAGAAAUAUUGGCmmu-miR-134UGUGACUGGUUGACCAGAGGGGmmu-miR-30eUGUAAACAUCCUUGACUGGAAGmmu-miR-184UGGACGGAGAACUGAUAAGGGUmmu-miR-127CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUmmu-miR-199aCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCmmu-miR-504AGACCCUGGUCUGCACUCUAUCmmu-miR-877GUAGAGGAGAUGGCGCAGGGmmu-miR-1930ACCUCCAUAGUACCUGCAGCGUmmu-miR-211UUCCCUUUGUCAUCCUUUGCCU

討　　論

Chen等[5]通過比較健康個(gè)體和糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血清存在42種表達(dá)有差異的microRNAs。Zampetaki 等[7]在一個(gè)大型前瞻性研究中，基于比較受試者的血漿microRNAs，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者有13種microRNAs 的表達(dá)與健康人不同。我們以Affymetrix的GeneChip miRNA 3.0 Array芯片分析顯示，胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs 顯著不同于正常對(duì)照小鼠，其中17種顯著上調(diào)，4種顯著下調(diào)。在顯著差異的21種microRNAs中，沒有紅細(xì)胞特有的miR-16 和 miR-451[14]，提示本研究中小鼠血清21種顯著差異的microRNAs 沒有受到溶血的影響。

Figure 2.FTO interaction network

圖2FTO及相關(guān)蛋白的相互作用

目前，與胰島素抵抗相關(guān)的microRNAs 已報(bào)道多種，主要基于對(duì)某組織的研究結(jié)果，與肝臟胰島素抵抗相關(guān)的有miR-29、miR-96、miR-33a/b、miR-181a、miR-122、miR-125、miR-126、miR-143、miR-802，與脂肪組織相關(guān)的有miR-93、miR-143、miR-221和miR- 223，與骨骼肌相關(guān)的有miR-135[15-16]。在2型糖尿病患者血漿的miR-199a[16]、miR-9、miR-29a、miR-30d、miR34a、miR-124a、miR-146a[6]、miR-28-3p[7]也顯著上調(diào)，miR-15a、miR-29b和miR-223下調(diào)[7]。

本研究中，未發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-29、miR-30d、miR-122、miR-96、miR-181a、miR34a、miR-124a、miR-146a、miR-28-3p、miR-802和miR-135在胰島素抵抗小鼠血清中存在顯著差異，但是，本研究中miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a和miR-199a 顯著上調(diào)。另外12種顯著上調(diào)的和4種顯著下調(diào)的microRNAs 未見與胰島素抵抗相關(guān)的報(bào)道，原因不清，或許與研究對(duì)象、臨床患者的其它并發(fā)癥、胰島素抵抗的病理學(xué)機(jī)制及病程的不同有關(guān)。

關(guān)于microRNAs引起胰島素抵抗的作用機(jī)制，相關(guān)報(bào)道有限。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-126通過下調(diào)胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)胰島素抵抗，IRS-1將胰島素信號(hào)從胰島素受體傳至細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路上的關(guān)鍵分子[16]。miR-199a可以結(jié)合廣泛分布于脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的胰島素敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucose transporter 4，GLUT4)的3’-UTR，降低GLUT4表達(dá)，參與了胰島素抵抗[17]。

miR-143是與胰島素抵抗關(guān)系密切的micro-RNAs之一，在高脂飲食的肥胖小鼠腸系膜和肝臟高表達(dá)，與體重及腸系膜脂肪重量相關(guān)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將miR-143過表達(dá)，小鼠表現(xiàn)為糖耐量異常和胰島素抵抗，進(jìn)一步的研究指出 miR-143通過作用于IRS-1-PI3K-PKB/Akt信號(hào)通路中的某些分子，參與小鼠肝細(xì)胞的胰島素抵抗[18-20]。在我們的研究中，應(yīng)用在線分析工具STRING發(fā)現(xiàn)miR-143可以結(jié)合FTO的3’-UTR。FTO蛋白是一種核酸修復(fù)酶，有研究發(fā)現(xiàn)FTO在骨骼肌等外周組織高表達(dá)[21]，可以通過多種途徑參與肥胖及2型糖尿病等相關(guān)疾病的發(fā)生[22-23]。以FTO為中心預(yù)測(cè)了它與另外10個(gè)與糖尿病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的蛋白R(shí)pgrip1l、Tmem 18、Mc4r、Npy、Hhex、Tcf712、Cdkal1、Slc30a8、Igf2bp2和 Thada的相互作用，對(duì)這些蛋白的研究將有助于胰島素抵抗機(jī)制的全面了解。

本文基于miRanda數(shù)據(jù)庫對(duì)另外一些差異表達(dá)microRNAs的靶基因預(yù)測(cè)表明這些microRNAs也存在多個(gè)靶基因位點(diǎn)。多靶位點(diǎn)存在有助于一個(gè)microRNA經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)[24]。

總之，本研究以微陣列芯片方法表明，在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠血清中有21種microRNAs相比正常小鼠出現(xiàn)了顯著變化，17種顯著上調(diào)，4種顯著下調(diào)。其中，有報(bào)道與胰島素抵抗相關(guān)的microRNAs包括miR-125、miR-126、miR-143、miR-30a和miR-199a。應(yīng)用miRBase 數(shù)據(jù)庫獲取了相關(guān)microRNAs的序列；基于這些microRNAs的序列，應(yīng)用在線分析工具發(fā)現(xiàn)與胰島素抵抗密切相關(guān)的miR-143可以結(jié)合FTO，并且預(yù)測(cè)了FTO與另外10種相關(guān)蛋白的相互作用，這將有助于對(duì)胰島素抵抗機(jī)制的全面了解。

[1]H?jlund K. Metabolism and insulin signaling in common metabolic disorders and inherited insulin resistance[J]. Dan Med J, 2014, 61(7):B4890.

[2]Gallagher IJ，Scheele C，Keller P，et al. Integration of microRNA changesinvivoidentifies novel molecular features of muscle insulin resistance in type 2 diabetes[J]. Genome Med, 2010, 2(2):9.

[3]Ling HY, Ou HS, Feng SD, et al. Changes in microRNA (miR) profile and effects of miR-320 in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2009, 36(9):e32-e39．

[4]Tung J. Exploring microRNA biomarkers for disease monitoring and response to therapy[J]. Bioanalysis, 2012, 4(18):2204.

[5]Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of micro-RNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]. Cell Res,2008, 18(10): 997-1006.

[6]孔磊, 韓文霞, 姜秀云，等. 2型糖尿病發(fā)病過程中外周血miR-34a 的表達(dá)水平及其臨床意義[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2010, 48(10):1-3.

[7]Zampetaki A, Kiechi S, Drozdov I, et al. Plasma micro-RNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in 2 type diabetes[J]. Circ Res, 2010, 107(6):810-817.

[8]陳麗， 蘭珍， 張丹. 不同肥胖標(biāo)準(zhǔn)在評(píng)估多囊卵巢綜合征胰島素抵抗中的價(jià)值[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2013, 44(6):945-949.

[9]Haffner SM, Kennedy E, Gonzalez C, et al. A prospective analysis of the HOMA model. The Mexico City Diabetes Study[J]. Diabetes Care, 1996, 19(10):1138-1141.

[10]夏偉, 曹國軍, 邵寧生. MicroRNA靶基因的尋找及鑒定方法研究進(jìn)展[J].中國科學(xué)C輯:生命科學(xué), 2009, 39(1):121-128.

[11]Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(Database issue):D68-D73.

[12]Franceschini A, Szklarczyk D, Frankild S, et al. STRING v9.1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration [J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(Database issue):D808-D815.

[13]Loos RJ, Yeo GS. The bigger picture of FTO:the first GWAS-identified obesity gene[J]. Nat Rev Endocrino, 2014, 10(1):51-61.

[14]Kirschner MB, Kao SC, Edelman JJ, et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma[J]. PLoS One, 2011, 6(9):e24145.

[15]薛慧良，王曉梅. miRNAs在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用糖尿病雜志, 2013, 9(2):59-60.

[16]王曉晶，聶敏，孫梅勵(lì). MicroRNAs與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的研究進(jìn)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014, 34(9):1272-1276.

[17]Yan ST, Li CL, Tian H,et al. MiR-199a is overexpressed in plasma of type 2 diabetes patients which contributes to type 2 diabetes by targeting GLUT4[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 397(1-2):45-51.

[18]張向君. MicroRNA-143在肥胖及胰島素抵抗中的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013, 26(6):666-668.

[19]Takanabe R, Ono K, Abe Y, et al. Up-regulated expression of microRNA-143 in association with obesity in adipose tissue of mice fed high-fat diet[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 376(4):728-732.

[20]Esau C, Kang X, Peralta E, et al. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation [J]. J Biol Chem, 2004, 279(50):52361-52365.

[21]Fredriksson R, Hagglund M, Olszewski PK, et al. The obesity gene, FTO, is of ancient origin, up-regulated during food deprivation and expressed in neurons of feeding-related nuclei of the brain[J]. Endocrinology, 2008, 149(5): 2062-2071.

[22]Zdrojowy-Welna A, Tupikowska M, Kolackov K, et al. The role of fat mass and obesity-associated gene (FTO) in obesity:an overview[J]. Endokrynol Pol, 2014, 65(3): 224-231.

[23]肖志華，郭武華，張吉翔.FTO基因與肥胖關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(5): 1025-1028.

[24]王清蘭，李俊霞，呂靖，等. CCl4誘導(dǎo)的小鼠纖維化肝組織微小RNA差異表達(dá)譜及初步功能分析[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(12):2201-2211.

(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Chip and informatic analysis of serum microRNA levels in insulin-resis-tant mice

XU Zhi-wei, WANG Wen-dong, CHANG Xiao-tong

(DepartmentofBiochemistry,CollegeofLabMedicine,NorthUniversityofHebei,Zhangjiakou075000,China.E-mail:changxt1212@vip.sina.com)

AIM: To study the microRNA profiling in the serum of insulin-resistant mice and the mechanism of insulin resistance induced by related microRNAs. METHODS: A high-fat diet was used to induce insulin resistance model in KM mice. The microRNA profiling in serum of insulin-resistant and normal mice was analyzed by microarray chip and were validated by real-time PCR. miRanda data base was used to forecast target genes. miRBase was used to obtain the sequences of related microRNAs, based on which protein interactions were predicted using the online analytical tool STRING. RESULTS: In serum of insulin-resistant mice, the expression of miR-125, miR-126, miR-143, miR-30a, miR-199a, miR-127, miR-184, miR-30e, miR-134, miR-195, miR-206, miR-429, miR-212, miR-362, miR-382, miR-154 and miR-466h was significantly up-regulated. miR-211， miR-504， miR-877 and miR-1930 were significantly down-regulated. miR-143 associated with insulin resistance was able to bind to 3’-UTR of fat mass and obesity-associated protein (FTO), and FTO was found to interact with Rpgrip1l, Tmem18, Mc4r, Npy, Hhex, Tcf712, Cdkal1, Slc30a8, Igf2bp2 and Thada. CONCLUSION: Twenty-one microRNAs in the serum of insulin-resistant mice induced by a high-fat diet are significantly different from those of normal mice, in which 17 kinds were significantly up-regulated. miR-143 closely related to insulin resistance is able to regulate FTO protein expression, which interacts with other 10 proteins associated with the occurrence and development of diabetes. The results are also useful for further study of the molecular mechanisms in insulin resistance.

Insulin resistance; MicroRNAs; Chip; Informatics

1000- 4718(2016)04- 0738- 07

2015- 08- 07

2016- 02- 29

張家口市科技局項(xiàng)目(No. 12110065G-5);河北省教育廳項(xiàng)目(No.QN2016175)

Tel: 0303-4029270； E-mail: changxt1212@vip.sina.com

R363.1+4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.026

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net