張麗，上官新晨，尹忠平，張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌,330045)

常見食品組分及金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

張麗，上官新晨，尹忠平，張清峰*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌,330045)

黃酮落新婦苷不穩(wěn)定，在中性和弱堿性條件下易發(fā)生異構(gòu)化和分解反應(yīng)，該文利用HPLC研究了常見食品組分及金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果表明，常見食品添加劑VC、蔗糖和β-CD可以提高落新婦苷的穩(wěn)定性，而苯甲酸鈉無明顯影響。β-CD通過包結(jié)反應(yīng)同時抑制落新婦苷異構(gòu)化和分解反應(yīng)；而VC和蔗糖則會加速落新婦苷的異構(gòu)化，但抑制其分解反應(yīng)。Al3+、Mg2+、Ca2+、Na+、K+等金屬離子可以輕微增強(qiáng)落新婦苷的穩(wěn)定性，其中Na+效果較好。Fe3+會顯著促進(jìn)落新婦苷分解反應(yīng)，降低其穩(wěn)定性; 而Al3+可完全抑制落新婦苷的異構(gòu)化反應(yīng)，但對其分解反應(yīng)無影響。食品組分蛋白質(zhì)和淀粉對落新婦苷的穩(wěn)定性影響不大，其中牛血清蛋白輕微增強(qiáng)其穩(wěn)定性，而淀粉有輕微的減弱作用。

落新婦苷；異構(gòu)化；分解；穩(wěn)定性

落新婦苷是一種廣泛存在于植物中的二氫黃酮類化合物，在許多水果、中藥及其加工食品中都有發(fā)現(xiàn)，如葡萄[1]、土茯苓[2-3]、、黃杞葉(羅漢茶)[4]、葡萄酒[1]、龜苓膏[5]等。已有研究表明落新婦苷具有多種顯著的生物學(xué)活性，包括強(qiáng)抗氧化活性、降血糖、調(diào)節(jié)脂肪代謝、選擇性免疫抑制等[6]。

黃酮類化合物通常較不穩(wěn)定，熱、光、pH等外界環(huán)境因素都可能引起其降解，并與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[7]。MAINI等比較了4種黃酮，高良姜精、山柰酚、槲皮素、楊梅素在紫外光照射及不同培養(yǎng)基溶液中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明黃酮穩(wěn)定性與B環(huán)上羥基數(shù)目有關(guān)，羥基數(shù)目越多則越不穩(wěn)定[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同品牌龜苓膏中落新婦苷含量差異巨大，有些甚至沒有，一個可能原因是不合適的生產(chǎn)工藝和貯藏條件導(dǎo)致了落新婦苷的降解[5]。LANDRAULT等發(fā)現(xiàn)葡萄酒中落新婦苷含量隨其貯藏、陳化時間而發(fā)生變化[1]，但未給出原因。作者前期通過HPLC研究了溫度、pH、溶劑等因素對落新婦苷單體穩(wěn)定性的影響[8]。然而，食品中的落新婦苷不是單獨(dú)存在的。因此，本文研究常見的食品組分及金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

落新婦苷由本實(shí)驗(yàn)室從土茯苓中純化，經(jīng) UV、IR、MS and NMR 鑒定，純度>98%；分析純NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuSO4、FeCl3、AlCl3、ZnCl2、苯甲酸鈉、抗壞血酸、甲醇、可溶性淀粉等,購自天津永大化學(xué)試劑有限公司；蔗糖(食用級)，購自安琪酵母(赤峰)有限公司；β-環(huán)糊精(β-CD)，購自江蘇豐園生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)：(分析純)，購自上海晶純生化科技股份有限公司；色譜純乙腈,購自RCI Labscan (Bangkok,Thailand)。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC為安捷倫1260系統(tǒng)，配自動進(jìn)樣器和二極管陣列檢測器；色譜柱為Waters Symmatry C18柱 (250 mm×4.6mm i.d.,5μm)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

HPLC流動相為乙腈(A)及 0.1%醋酸水溶液(B)。線性梯度程序?yàn)?～15 min，16%～21% A；15～40 min，21%～40% A。流速為1 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，檢測波長為 291 nm。

1.3.2 落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取20 mg落新婦苷，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶解，定容于10 mL的容量瓶中，得到2 mg/mL的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于4 ℃冰箱備用。同樣步驟配制濃度為10 mg/mL的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 食品添加劑對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液將2 mg/mL的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，分別與用雙蒸水配制的20 mmol抗壞血酸、10%蔗糖、20 mmol/L苯甲酸鈉、1% β-CD等體積混合后，放置于45 ℃水浴中，每間隔1 h取樣，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用HPLC測定溶液中剩余落新婦苷的濃度及其異構(gòu)體的濃度。

1.3.4 金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

用雙蒸水將2 mg/mL的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，分別與濃度都為2 mmol/L的Mg2+、Cu2+、Ca2+、 Na+、K+、Fe3+、Al3+、Zn2+等金屬離子溶液(雙蒸水配制)等體積混合。放置于45 ℃水浴中，每間隔1 h取樣，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用用HPLC測定溶液中剩余落新婦苷的濃度及其異構(gòu)體的濃度。

1.3.5 牛血清蛋白和淀粉對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液將10 mg/mL的落新婦苷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，取此溶液2.5 mL與2%的牛血清蛋白溶液或淀粉溶液等體積混合，放置于45 ℃水浴中，每間隔1 h取樣0.2 ml，加入0.8 mL的純甲醇，渦旋混勻5 min,10 000 r/min離心5 min，過0.45 μm濾膜后用HPLC測定溶液中剩余落新婦苷的濃度及其異構(gòu)體的濃度。

1.4 分解速率常數(shù)和半衰期計(jì)算

根據(jù)不同時間HPLC測定的落新婦苷濃度，用一級數(shù)學(xué)模型模擬落新婦苷的分解動力學(xué)，計(jì)算落新婦苷及其異構(gòu)體在不同條件的分解速率常數(shù)和半衰期，具體公式為[8]：

ln(Ct/C0)=-k×t

(1)

t1/2=-ln0.5×k-1

(2)

式中:C0為落新婦苷初始濃度；Ct為t時刻落新婦苷及其異構(gòu)體濃度之和；k為降解速率常數(shù)；t1/2為半衰期。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)2次，取平均值，使用Origin 8.0 (Origin Lab Co.,Northampton,MA,USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、計(jì)算、繪圖和曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見食品添加劑對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

根據(jù)落新婦苷分子結(jié)構(gòu)，其在C2和C3位上存在立體異構(gòu)現(xiàn)象，分別有2(R):3(R) (落新婦苷)、2(S):3(S)(新落新婦苷)、2(S):3(R)(新異落新婦苷)和2(R):3(S) (異落新婦苷)4種順、反異構(gòu)體[9]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)pH和溫度會顯著影響落新婦苷異構(gòu)化和分解反應(yīng)，主要異構(gòu)化產(chǎn)物為新異落新婦苷。在酸性條件下，落新婦苷很穩(wěn)定；在中性和弱堿性條件下以異構(gòu)化為主，分解速率較慢；當(dāng)pH值大于10后幾乎不發(fā)生異構(gòu)化而直接分解。溫度升高會加快落新婦苷的異構(gòu)化和分解速率[8]。因此本文不再考察溫度和pH的影響，在45 ℃，pH 8.0固定條件下研究常見食品添加劑苯甲酸鈉、VC、蔗糖、β-CD對落新婦苷異構(gòu)化和分解的影響。

圖1-A為不同食品添加劑對落新婦苷保留率的影響。

與對照相比，VC、蔗糖、β-CD都可顯著提升落新婦苷的保留率，β-CD效果最為顯著，VC其次；而常用防腐劑苯甲酸鈉無任何影響。減少的落新婦苷除發(fā)生分解外，一部分轉(zhuǎn)化為其異構(gòu)體新異落新婦苷(圖1-D中峰2)。圖1-B為新異落新婦苷的生成情況。無添加劑條件下，2 h時約有25%的新異落新婦苷生成，隨后其含量逐漸減少，說明新異落新婦苷也在逐漸分解。與對照相比，β-CD顯著抑制落新婦苷的異構(gòu)化，新異落新婦苷的最大生成量僅為10%；而VC和蔗糖則加速新異落新婦苷的生成，最大生成量達(dá)到35%。圖1-C為落新婦苷和新異落新婦苷濃度之和隨時間的變化曲線，反映其分解情況。VC、蔗糖和β-CD可顯著減少落新婦苷和新異落新婦苷的分解。對照條件下，10 h后落新婦苷和新異落新婦苷濃度之和僅為落新婦苷初始濃度的33%；而VC組為74.5%；蔗糖與β-CD效果相當(dāng)，保留率為53%。落新婦苷及其異構(gòu)體的具體分解產(chǎn)物還不明確。MAINI等通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了槲皮素、山柰酚等黃酮的主要分解產(chǎn)物，主要為三羥基苯及苯甲酸類衍生物[7]。

表1為由圖1-C數(shù)據(jù)通過一級數(shù)學(xué)模型擬合得到的落新婦苷和新異落新婦苷的分解動力學(xué)參數(shù)。45 ℃條件下，在pH 8.0的磷酸緩沖液中，落新婦苷和新異落新婦苷的分解速率常數(shù)為0.132 0，分解半衰期為5.25 h。在溶液中添加VC可有效提高落新婦苷和新異落新婦苷的穩(wěn)定性，抑制其分解，分解速率常數(shù)減少至為0.023 1，分解半衰期延長至30 h。β-CD和蔗糖抑制落新婦苷和新異落新婦苷分解的效果相當(dāng)，而苯甲酸鈉沒有影響。β-CD 具有特殊的外親水內(nèi)疏水的空腔結(jié)構(gòu)，空腔大小適中，可與落新婦苷形成絡(luò)合物[10]。因此，β-CD抑制落新婦苷異構(gòu)化和分解的機(jī)制應(yīng)該是源于其空腔的保護(hù)作用。由于β-CD與落新婦苷絡(luò)合物的形成常數(shù)隨著溫度的降低而增大，因此，在低溫條件下β-CD提升落新婦苷穩(wěn)定性的效果會更佳。VC和蔗糖可以加速落新婦苷異構(gòu)化，同時抑制其分解，但機(jī)制還不明確，將在后續(xù)研究中展開。

A-落新婦苷保留率；B-落新婦苷異構(gòu)體的生成情況；C-落新婦苷及其異構(gòu)體分解；D-儲存4 h后落新婦苷不同條件下的HPLC色譜圖。峰1-落新婦苷，峰2-新異落新婦苷?！?空白對照；○-VC;△-蔗糖；▽-苯甲酸鈉；◇-β-CD圖1 常見食品添加劑對落新婦苷穩(wěn)定性的影響Fig.1 The effect of different food additives on the stability of astilbin

注：—，溶液體系中有Fe3+時，落新婦苷分解過快，無法計(jì)算其半衰期。

2.2 常見金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

圖2為食品中常見金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響。圖2-A表明本實(shí)驗(yàn)測試的大部分金屬離子有提高落新婦苷保留率的作用。但Fe3+使溶液中落新婦苷的含量迅速減少。圖2-B說明大部分金屬離子可抑制落新婦苷的異構(gòu)化，減少新異落新婦苷的生成量，從而提升落新婦苷的保留率，效果最為明顯的是Fe3+和Al3+，10h內(nèi)落新婦苷異構(gòu)體的生成量幾乎為零；Mg2+、Ca2+、Cu2+、 Na+、K+等也能延緩落新婦苷異構(gòu)體的形成，而Zn2+幾乎沒有影響。圖2-C反映不同金屬離子存在條件下落新婦苷和新異落新婦苷的分解情況。結(jié)合表1的分解速率常數(shù)和半衰期擬合數(shù)據(jù)，結(jié)果表明Al3+、Mg2+、Ca2+、 Na+、K+等金屬離子可以輕微延緩落新婦苷及其異構(gòu)體的分解，具有增穩(wěn)作用，其中Na+效果相對較好，使落新婦苷的半衰期延長了2.2倍；Cu2+、Zn2+和Fe3+會加速落新婦苷及其異構(gòu)體的分解。特別是Fe3+促進(jìn)落新婦苷分解的效果特別明顯，加入Fe3+1 h后，僅剩余不到25%的落新婦苷。圖2-D為Fe3+存在條件下5 h時落新婦苷的HPLC色譜圖，未發(fā)現(xiàn)新異落新婦苷的的生成，說明Fe3 +直接促使落新婦苷發(fā)生分解而非異構(gòu)化。這可能是因?yàn)槁湫聥D苷結(jié)構(gòu)中存在酚羥基，具有抗氧化作用，而Fe3+具有氧化性，因此能迅速破壞落新婦苷的結(jié)構(gòu)，降低其穩(wěn)定性。而Al3+能夠完全抑制落新婦苷異構(gòu)化的機(jī)制還不明確。

A-落新婦苷保留率；B-落新婦苷異構(gòu)體的生成情況；C-落新婦苷及其異構(gòu)體分解情況；D-儲存5 h后落新婦苷在在對照和含F(xiàn)e3+溶液中的HPLC色譜圖，峰1-落新婦苷，峰2-新異落新婦苷圖2 常見金屬離子對落新婦苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effect of different metal ions on the stability of astilbin

2.3 牛血清蛋白和淀粉對落新婦苷穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)和多糖是大多食品中的主要組分。圖3-A結(jié)果表明，在有牛血清蛋白的體系中，落新婦苷的保留率輕微高于對照組，而在淀粉體系中，落新婦苷的保留率輕微低于對照組。圖3-B為落新婦苷異構(gòu)體形成情況，牛血清蛋白能夠促進(jìn)落新婦苷異構(gòu)體的形成，而淀粉能夠延緩落新婦苷的發(fā)生異構(gòu)化。圖3-C為落新婦苷及其異構(gòu)體的分解情況。結(jié)合表1的分解速率常數(shù)和半衰期擬合數(shù)據(jù)，結(jié)果表明牛血清蛋白可以輕微延緩落新婦苷及其異構(gòu)體的分解，具有增穩(wěn)作用，使落新婦苷的半衰期延長了2 h。蛋白質(zhì)對落新婦苷的增穩(wěn)作用可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)與蛋白質(zhì)有較好的親和性，能形成復(fù)合物。方茹等研究發(fā)現(xiàn)在牛血清蛋白能通過氫鍵與黃酮結(jié)合，在有牛血清蛋白體系中黃酮的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)作用[11]。淀粉會促進(jìn)落新婦苷及其異構(gòu)體的分解，但作用機(jī)制還不明確。

A-落新婦苷保留率；B-落新婦苷異構(gòu)體的生成情況；C-落新婦苷及其異構(gòu)體分解情況圖3 牛血清蛋白和淀粉對落新婦苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of bovine serum albumin and starch on the stability of astilbin

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常見食品添加劑VC、蔗糖、β-CD對落新婦苷有增穩(wěn)作用，而常用防腐劑苯甲酸鈉無作用。其中β-CD能同時抑制落新婦苷的異構(gòu)化分解反應(yīng)；而VC和蔗糖會促進(jìn)落新婦苷發(fā)生異構(gòu)化，但抑制其分解。Cu2+、Zn2+和Fe3+會降低落新婦苷的穩(wěn)定性，其中Fe3+使落新婦苷迅速分解；Al3+會完全抑制落新婦苷的異構(gòu)化反應(yīng)，但對其分解反應(yīng)無影響；Na+對落新婦苷有一定的增穩(wěn)作用。牛血清蛋白能輕微提高落新婦苷的穩(wěn)定性，而淀粉則對落新婦苷的分解有輕微促進(jìn)作用。落新婦苷有多種顯著的生物活性，在貯藏和加工含落新婦苷食品時，應(yīng)盡量避免不利因素，減少落新婦苷的分解，最大程度地發(fā)揮其生物功效。

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Effectoffoodcomponentsandmetalionsonthestabilityofastilbin

ZHANG Li，SHANGGUAN Xin-chen,YIN Zhong-ping，ZHANG Qing-feng*

(Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food,College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Astilbin is an unstable dihydroflavonol and easy to be isomerization and decomposed under neutral and weak alkaline medium.In the present study,the effects of different food components on the stability of astilbin was studied by HPLC.The results showed that common food additives VC,saccharose and β-cyclodextrin (β-CD) could significantly improve stability,while sodium benzoate has no effect.It is found that β-CD could suppress isomerization and decomposition of astilbin through complexation; while VCand saccharose accelerate the isomerization but suppress the decomposition.Metal ions,such as Al3+，Mg2+，Ca2+，Na+，K+could slightly improve the stability of astilbin,and Na+showed the best effect.Fe3+significantly improved the decomposition of astilbin but decreased its stability; Al3+completely inhibited the isomerization of astilbin but has no effect on its decomposition.The major components of food,protein (bovine serum albumin) and starch,have slight effects on the stability of astilbin.

astilbin; isomerization; decomposition; stability

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013399

碩士研究生(張清峰副教授為通訊作者，E-mail：zhqf619@126.com)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31760461)；江西省教育廳基金項(xiàng)目(GJJ160416)；江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(2015003)

2016-11-14，改回日期：2017-09-21