李淑娟，李紅俊，呂曉東，姚彩紅，周 莎

(寧夏計量質(zhì)量檢驗檢測研究院(國家煤化工產(chǎn)業(yè)計量測試中心)，寧夏 銀川 750411)

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實等中，大多都以O(shè)-糖苷的形式出現(xiàn)。黃酮類化合物具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、保護心血管[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和對艾滋病病毒 (HIV) 有很強的抑制增殖作用[7]等多種生理活性和藥理作用。蛋白質(zhì)是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子，探討具有藥理活性的天然產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的相互作用作用機理，對于了解藥物發(fā)揮藥效的作用機制，揭示藥物藥效的實質(zhì)內(nèi)涵具有重要意義。人血清白蛋白(HSA)可以運輸和儲存脂肪酸、氨基酸、類固醇激素、金屬離子及許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，同時維持血液正常的滲透壓[8]。已報道的有芹菜素、地念黃酮類化合物、橙皮苷、貝加因黃酮、葛根素、山奈素等黃酮與血清白蛋白的相互作用，然而還未見報道異甘草甙、新異甘草甙與血清白蛋白的作用。

異甘草甙(Isoliquiritin)與新異甘草甙(Neoisoliquiritin)是兩種藥效較強的O-糖苷查爾酮(如圖1所示)黃酮類化合物，本文采用熒光光譜法研究這兩種化合物與人血清白蛋白 (HSA) 的相互作用。

圖1 異甘草甙(1)和新異甘草甙(2)的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of Isoliquiritin(1) and Neoisoliquiritin(2)

1 實 驗

1.1 主要儀器與試劑

儀器：RF-5301 PC熒光分光光度計，日本Shimadzu公司；F-4600 FL熒光分光光度計，日本Hitachi公司；pHS-3C型酸度計，上海雷磁儀器廠；國華HH-6數(shù)字恒溫水浴，江蘇常州國華電器有限公司。

試劑：異甘草甙和新異甘草甙(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；人血清白蛋白HSA，相對分子質(zhì)量以66478計，sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl、HCl等均為分析純試劑；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

HSA溶液：用水配成1.0×10-5mol/L，0～4 ℃ 冰箱內(nèi)保存；異甘草甙和新異甘草甙溶液：用無水乙醇配成0.5×10-4mol/L溶液；pH 7.4的Tris-HCl 緩沖溶液：0.05 mol/L Tris-0.15 mol/L HCl-0.50 mol/L NaCl的混合溶液。

在10 mL容量瓶中依次加入一定量的異甘草甙/新異甘草甙溶液和0.5 mL HSA溶液，用緩沖溶液稀釋定容，搖勻，分別恒溫靜置一段時間，然后固定 λex=280 nm，選定激發(fā)和發(fā)射狹逢均為10 nm， 掃描樣品在288～480 nm之間的熒光光譜；固定Δλ=15 nm或Δλ=60 nm，記錄異甘草甙/新異甘草甙與HSA作用的同步熒光光譜；室溫下分別掃描HSA和HSA與異甘草甙/新異甘草甙的三維光譜，掃描間隔10 nm，激發(fā)和發(fā)射狹逢均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 異甘草甙、新異甘草甙對HSA的熒光猝滅光譜和猝滅機制

2.1.1 熒光猝滅光譜

不同濃度的異甘草甙、新異甘草甙對 HSA 的熒光猝滅光譜見圖2。由圖2可知，異甘草甙和新異甘草甙在水溶液中幾乎不發(fā)射熒光，但其分別加入到 HSA 中會引起 HSA 的內(nèi)源熒光強度有規(guī)律地降低。同時，新異甘草甙的加入還導(dǎo)致 HSA 的特征發(fā)射波長產(chǎn)生了微弱藍移。該結(jié)果表明，異甘草甙、新異甘草甙均與 HSA 存在著相互作用。

圖2 不同濃度的異甘草甙、新異甘草甙對HSA的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of HSA at different concentrations of isoliquiritin and neoisoliquiritin (pH=7.4, T=298 K, λex=280 nm)

2.1.2 猝滅機制

熒光猝滅根據(jù)猝滅方式的不同，可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種。為了確定猝滅類型，運用Stern - Volmer方程[9]對數(shù)據(jù)進行處理。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

式中:F0和F分別為猝滅劑加入前后體系的熒光強度；Kq為猝滅常數(shù)，單位是L/(mol·s)；KSV為雙分子猝滅過程常數(shù)，單位為 L/mol；τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s；[Q]為猝滅劑濃度，單位是L/mol。

以F0/F對的[Q]作圖得到Stern-Volmer曲線圖，猝滅參數(shù)見表1。結(jié)果表明：異甘草甙、新異甘草甙與HSA 相互作用的KSV均隨著溫度的升高而降低，且Kq值遠大于動態(tài)猝滅中各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)，由此可以初步推斷，異甘草甙、新異甘草甙對HSA的熒光猝滅可能是與 HSA 結(jié)合形成了新的基態(tài)復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅過程[10]。

表1 不同溫度下異甘草甙、新異甘草甙與HSA相互作用的Stern-Volmer猝滅參數(shù)和結(jié)合參數(shù)Table 1 Stern-volmer quenching constants and binding parameters for interaction of HSA with isoliquiritin and neoisoliquiritin at different temperatures

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的確定

當藥物小分子與白蛋白結(jié)合的位點數(shù)n和結(jié)合常數(shù)Kb可根據(jù)表達式[11]log(F0/F-1)=logKb+nlog[Q]求算。通過log(F0-F)/F對log[Q]的作圖，可得到298，305，312 K下的結(jié)合常數(shù)Kb和作用位點數(shù)n，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：異甘草甙、新異甘草甙在HSA上都僅有一個結(jié)合位點；隨著溫度升高，異甘草甙和HSA的結(jié)合常數(shù)Kb逐漸升高。而新異甘草甙與HSA 的結(jié)合常數(shù)Kb逐漸降低，進一步證明新異甘草甙與HSA的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

2.3 異甘草甙、新異甘草甙與HSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

分子間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，根據(jù) Van’t Hoff 公式[12]：lnKA=-ΔH0/RT+ ΔS0/R，以lnKA對 1/T 作圖，得異甘草甙與 HSA 相互作用的方程為lnKA=-15.71+8075.57/T；新異甘草甙與 HSA 相互作用的方程為lnKA=21.14-3024.68/T；根據(jù)熱力學(xué)公式分別求出ΔH°、ΔS° 和ΔG°，結(jié)果見表1。異甘草甙與HSA 作用的ΔH°<0且ΔS°<0，表明異甘草甙與HSA相互作用力主要是氫鍵或范德華力。新異甘草甙與HSA作用的ΔH°>0且ΔS°>0，表明新異甘草甙與HSA相互作用力主要是疏水相互作用。異甘草甙、新異甘草甙與HSA相互作用的ΔG°<0，說明兩個化合物與HSA的相互作用過程一個吉布斯自由能降低的自發(fā)過程。

2.4 異甘草甙、甘草甙對HSA 構(gòu)象的影響

Δλ=15 nm所作同步熒光光譜顯示酪氨酸殘基的光譜特征，而Δλ=60 nm的同步熒光光譜僅顯示色氨酸殘基的光譜特征。根據(jù)實驗結(jié)果，隨著異甘草甙濃度的增加，酪氨酸殘基熒光強度降低但發(fā)射波長未出現(xiàn)明顯移動，色氨酸殘基的熒光強度降低且最大發(fā)射波長紅移，由此可知異甘草甙對 HSA 的熒光猝滅主要是相互作用后導(dǎo)致色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性降低，極性增加，影響了熒光強度。隨著新異甘草甙濃度的增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長均發(fā)生紅移，表明新異甘草甙與 HSA 的作用改變了酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性，疏水性降低，導(dǎo)致 HSA 的結(jié)構(gòu)變得疏松。

進一步采用三維熒光光譜考察了異甘草甙、新異甘草甙對 HSA 構(gòu)象的影響。沒有加入猝滅劑時時HSA的(λex/λem, F)是(280.0/330.0, 616.8)；向HSA中加入異甘草甙后，HSA的(λex/λem, F)是(280.0/320.0, 401.6)，熒光峰強度降低了215.2，HSA的熒光峰藍移10 nm；向HSA中加入新異甘草甙后，HSA的(λex/λem, F)是(280.0/310.0, 327.8)，熒光峰強度降低了299.0，HSA的熒光峰藍移20 nm。很明顯，異甘草甙和新異甘草甙對HSA的熒光均有猝滅作用，但是新異甘草甙對HSA的猝滅作用更強。結(jié)合同步熒光的分析結(jié)果，異甘草甙與HSA的結(jié)合部位主要在色氨酸殘基所處的疏水腔中，新異甘草甙與HSA的結(jié)合部位可能處于酪氨酸和色氨酸殘基所處疏水腔中，從而引起疏水腔微環(huán)境極性的改變，進而導(dǎo)致了HSA構(gòu)象的變化。

從異甘草甙和新異甘草甙的結(jié)構(gòu)來看，兩個化合物的雙鍵O均和A環(huán)中的2位羥基H形成了很強的分子內(nèi)氫鍵，氫鍵的形成在一定程度上增加了體系的穩(wěn)定性；異甘草甙是B環(huán)上4′位羥基與葡萄糖形成的黃酮苷，新異甘草甙是A環(huán)上4位羥基與葡萄糖形成的黃酮苷，并結(jié)合異甘草甙、新異甘草甙與 HSA 的作用力不同，及對 HSA 構(gòu)象的影響，發(fā)現(xiàn)新異甘草甙使HSA藍移程度更大，可能是B環(huán)上4′位羥基影響的結(jié)果[13]，據(jù)此推斷新異甘草甙可能具有比異甘草甙更強的抗氧化能力。

3 結(jié) 論

本文首次應(yīng)用熒光猝滅法、同步熒光光譜法和三維熒光光譜法研究了O-糖苷查爾酮黃酮類化合物異甘草甙、新異甘草甙與HSA的相互作用。結(jié)果表明：異甘草甙、新異甘草甙對HSA的內(nèi)源熒光都有猝滅作用，猝滅類型都為靜態(tài)猝滅，結(jié)合為點數(shù)n≈1。異甘草甙與HSA相互作用力主要是氫鍵或范德華力；新異甘草甙與 HSA相互作用力主要是疏水相互作用。同時利用同步熒光光譜和三維熒光光譜探討了對HSA構(gòu)象的影響。新異甘草甙使HSA藍移的程度更大，推測可能是B 環(huán)上4′位羥基影響的結(jié)果，根據(jù)實驗結(jié)果和文獻推斷新異甘草甙可能比異甘草甙具有更強的抗氧化能力。本文所獲結(jié)果可以為更深入地了解黃酮與血清蛋白的作用機制，改造黃酮小分子，尋找新的藥物小分子提供有價值的信息。