蘇曉妹　方宇星　劉鈺龍　劉峰　張所兵　張云輝，*　鮑依群，*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014；*通訊聯(lián)系人， E-mail: baoyiqun@njau.edu.cn, zyhrice@163.com)

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水稻矮稈多分蘗突變體mz3的遺傳分析和基因定位

蘇曉妹1方宇星1劉鈺龍1劉峰1張所兵2張云輝2，*鮑依群1，*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014；*通訊聯(lián)系人， E-mail: baoyiqun@njau.edu.cn, zyhrice@163.com)

SU Xiaomei, FANG Yuxing, LIU Yulong, et al. Genetic analysis and gene mapping of a dwarf and high-tillering mutantmz3 in rice (OryzasativaL.). Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 479-486.

通過EMS誘變粳稻品種中花11獲得一個穩(wěn)定遺傳的矮稈多分蘗突變體mz3。遺傳分析表明該突變性狀受一對隱性基因控制，并利用mz3與秈稻品種南京11雜交建立的F2群體，將該基因定位在水稻第6染色體長臂上的SSR標(biāo)記RM19353與RM510之間約747 kb范圍內(nèi)。由于該區(qū)間包含控制水稻株高和分蘗的D3基因，結(jié)合表型分析，推測突變基因與D3可能為一對等位基因。設(shè)計7對引物分別對中花11與突變體mz3的基因進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，與中花11相比，D3基因在mz3中第636位核苷酸由G突變?yōu)锳，使得編碼色氨酸的密碼子TGG突變?yōu)榻K止密碼子TGA，導(dǎo)致翻譯提前終止。進(jìn)一步對定位群體中10個隱性極端個體測序，結(jié)果顯示所有極端個體都帶有該突變位點。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，突變體編碼的D3蛋白與野生型一樣定位在細(xì)胞核中，熒光雙分子互補試驗結(jié)果表明，突變體D3蛋白不能與D14蛋白發(fā)生互作，推測突變體編碼的D3截短蛋白缺少了與D14互作的氨基酸序列，從而阻礙了獨腳金內(nèi)酯信號傳遞。因此，mz3表型很可能由D3基因突變引起。

水稻； 矮稈多分蘗； D3； 基因定位

20世紀(jì)60年代，半矮稈基因sd1的成功應(yīng)用掀起了水稻生產(chǎn)上的一次“綠色革命”，第一次實現(xiàn)了矮稈基因在育種中的應(yīng)用，使水稻的產(chǎn)量提高了20%～30%[1]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定的水稻矮稈突變體超過60個[2]，其中30多個水稻矮稈基因被克隆[3]。有研究表明，水稻的株高與分蘗數(shù)負(fù)相 關(guān)[4-5]，而株高與分蘗數(shù)量在一定程度上決定了水稻的產(chǎn)量[6]。通過對水稻分蘗機制的研究，多個與水 稻分蘗相關(guān)的基因已被克隆[7]。其中，控制水稻分蘗的MOC1基因已被克隆，它能促進(jìn)分蘗芽的形成和發(fā)育，并能控制腋生分生組織的分化，該基因功能缺失突變體表現(xiàn)為單分蘗[8]。2008年Gomez-Roldan[9]等發(fā)現(xiàn)了一類新型的由倍半萜衍生而來的植物激素——獨腳金內(nèi)酯(strigolactones, SLs)，參與調(diào)控植物地上部分枝發(fā)育。SLs合成或信號途徑的相關(guān)基因發(fā)生突變，通常會造成植物分蘗或分枝數(shù)目的增加或減少，同時伴有株高變化[10]。SLs主要在植物根部合成，向上運輸來抑制植物側(cè)枝的生長，它對側(cè)枝發(fā)育的調(diào)節(jié)，是一個與植物生長素和細(xì)胞分裂素相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[9-11]。

SLs和脫落酸的合成一樣都是以類胡蘿卜素為前提，經(jīng)MEP途徑開始進(jìn)行合成[12-13]。目前了解到的調(diào)控合成的基因有四類：MAX3(同源基因為RMS5/D17/DAD3)編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCD7， 是SLs 合成過程中發(fā)現(xiàn)的第一個關(guān)鍵酶；MAX4(同源基因為RMS1/D10/DAD1)編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCD8，在CCD7 的下游起作用；D27/AtD27，編碼鐵結(jié)合蛋白；這三種基因參與獨腳金內(nèi)酯合成的第一步反應(yīng)，在質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行，之后在質(zhì)體外進(jìn)行合成的相關(guān)基因有MAX1，負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞色素P450[10，12-16]。而目前在不同植物中發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控SLs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因一共有三種：MAX2/RMS4/D3、D14/DAD2和D53/SMAX1[13]。MAX2/RMS4/D3編碼一類F-box轉(zhuǎn)錄因子蛋白，通過形成SCF (Skp1-Cullin-F-box)蛋白復(fù)合體，參與SLs信號的接收和轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，能介導(dǎo)泛素化蛋白的降解；D14/DAD2編碼α/β水解酶，可能是SLs的受體[17-19]；水稻D53編碼一個在結(jié)構(gòu)上與I類Clp ATP酶類似的蛋白，是獨腳金內(nèi)酯(SLs)信號途徑的抑制因子。在SLs存在的條件下與D14、D3形成蛋白復(fù)合體，D53蛋白被泛素化降解導(dǎo)致去抑制化，從而激活SLs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20-21]。

本研究從表型、遺傳等方面對矮稈多分蘗突變體mz3進(jìn)行鑒定，明確了相應(yīng)的遺傳特性，并對突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位——基因測序與突變位點分析，還進(jìn)一步進(jìn)行了亞細(xì)胞定位與雙分子熒光互補分析。通過對該突變體的研究，有利于進(jìn)一步了解水稻株型的分子機理，為株型育種提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

水稻矮稈多分蘗突變體mz3是從粳稻品種中花11的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變?nèi)后w中篩選得到的，經(jīng)過多代的自交觀察，該突變體的遺傳性狀穩(wěn)定。在正常生長條件下，成熟期隨機選取野生型與突變體各10株，對株高、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率、粒長、粒寬和粒厚等相關(guān)農(nóng)藝性狀進(jìn)行考查和統(tǒng)計分析。

以該突變體mz3與秈稻品種南京11雜交，構(gòu)建F2群體。從F2中挑選出106個具有矮稈多分蘗表型的單株，用于基因的精細(xì)定位。

1.2基因的連鎖分析

選用實驗室已有的均勻分布于水稻12條染色體上的463對SSR標(biāo)記，以親本中花11的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選mz3與南京11之間存在的多態(tài)性標(biāo)記。在F2群體中挑選10株突變體表型的單株，利用這些多態(tài)性標(biāo)記對突變基因進(jìn)行連鎖分析。

用CTAB小量法提取水稻基因組DNA[6-7]。采用10 μL 的PCR 擴(kuò)增體系，其中含10 ng DNA 模板，4 nmol 引物，0. 5 mmol dNTP，1 μL 10 × 緩沖液 和0. 5 UTaq聚合酶。PCR條件如下: 94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s， 72℃下延伸30 s， 33個循環(huán); 72℃下延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)19∶1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (電泳緩沖液0.5×TBE，電壓180 V，時間2.0 h)，快速銀染后觀察、照相、讀帶[22]。

1.3SSR標(biāo)記的開發(fā)與基因定位

根據(jù)初步定位結(jié)果，從已經(jīng)公布的水稻SSR標(biāo)記[23]中選擇合適的位點進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)，引物設(shè)計通過Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行。利用開發(fā)的多態(tài)性標(biāo)記對定位區(qū)間進(jìn)行標(biāo)記加密，通過染色體步移逐步縮小目標(biāo)區(qū)段。

1.4突變基因測序與后代驗證

通過水稻基因組注釋計劃(Rice Genome Annotation Project ，RAP-DB, http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)對最終定位區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測。發(fā)現(xiàn)與水稻分蘗相關(guān)的D3基因(Os06g0154200)位于區(qū)間內(nèi)。因此，設(shè)計了7對引物，對中花11和突變體mz3的D3基因編碼區(qū)以及啟動子區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、測序和比對，并在定位群體中隨機挑選10個隱性極端單株對突變位點進(jìn)行驗證。

1.5亞細(xì)胞定位

分別將野生型與mz3突變體中D3蛋白與GFP進(jìn)行融合，得到1305-D3WT-GFP和1305-D3MT-GFP兩個載體，后將載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將所得農(nóng)桿菌注射進(jìn)煙草表皮，培養(yǎng)2 d后采用激光共聚焦顯微鏡觀察。MADS53-mRFP作為細(xì)胞核定位標(biāo)記。

1.6D3、D14蛋白互作分析

將D3WT、D3MT基因分別克隆到載體p2YC中，將D14WT的基因克隆到載體p2YN中，后將載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將所得農(nóng)桿菌注射進(jìn)煙草表皮，培養(yǎng)2 d后利用激光共聚焦顯微鏡觀察。MADS53-mRFP作為細(xì)胞核定位標(biāo)記。

2　結(jié)果與分析

2.1突變體表型分析

表型調(diào)查結(jié)果表明，突變體mz3的株高降至野生型中花11的61.8%，分蘗數(shù)增加2.8倍(圖1)。對成熟期其他農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)突變體mz3的每穗粒數(shù)顯著減少，粒長、粒寬、粒厚顯著降低，千粒重顯著降低，但結(jié)實率與野生型相比沒有顯著差異(圖2)。

2.2遺傳分析

將mz3分別與野生型中花11和南京11雜交，結(jié)果顯示2個雜交組合的F1代均表現(xiàn)正常性狀。在mz3/南京11的F2定位群體中，隨機抽取204個單株調(diào)查，發(fā)現(xiàn)正常表型的157株，突變體表型的47株，符合3∶1分離比(X2=0.32)，表明該矮稈多分蘗表型由一對隱性基因控制。

圖1野生型中花11與突變體mz3的表型

Fig.1. Phenotype of wild type Zhonghua 11 and mz3.

2.3連鎖分析與精細(xì)定位

選用實驗室已有的均勻分布在水稻12條染色體上的463對SSR引物標(biāo)記，用兩個親本(mz3、南京11)DNA作模板進(jìn)行多態(tài)性分析。共篩選出具有多態(tài)性的引物155對，多態(tài)性頻率為33.48%。利用篩選出來的155對多態(tài)性引物對F2群體中隨機選取的10株突變個體進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)突變基因與水稻第6染色體長臂端的兩個SSR標(biāo)記RM190和RM510緊密連鎖。

根據(jù)已經(jīng)公布的SSR標(biāo)記圖譜[23]，在RM190和RM510附近重新開發(fā)了9個SSR標(biāo)記。其中6個在親本間具有多態(tài)性，并利用這些多態(tài)性標(biāo)記對mz3/南京11雜交F2群體中的106個單株進(jìn)行分析。最終將突變基因定位在RM19353和RM510標(biāo)記之間，與RM19391共分離，物理距離約為747 kb(圖3)。

2.4候選基因分析

測序結(jié)果顯示，mz3編碼區(qū)的第636位堿基由G突變成A，密碼子由TGG變?yōu)榻K止密碼子TGA，翻譯提前終止(圖4-A)。在mz3/南京11的F2定位群體中隨機選取10株隱性極端個體單株，以測序引物CX-3F/CX-3R擴(kuò)增包含突變位點的區(qū)段進(jìn)行測序。結(jié)果顯示這10個極端個體都帶有與mz3相同的突變位點(圖4-B)，再次證明突變表型很可能由D3基因的單堿基突變引起。

2.5亞細(xì)胞定位與雙分子熒光互補分析

為了初步闡明mz3突變體的突變機理，我們首先對野生型及突變型的D3蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。野生型中花11的D3蛋白主要定位在細(xì)胞核中(圖5-A)，而突變型的D3蛋白同樣能夠正確定位到細(xì)胞核中(圖5-B)。進(jìn)一步利用雙分子熒光互補試驗檢測了野生型及突變型D3蛋白與D14的互作情況，結(jié)果表明，雖然突變型的D3蛋白能夠定位在核中，但其不能與D14蛋白在細(xì)胞核中發(fā)生互作(圖6-B)，而野生型的D3與D14能夠在核中結(jié)合(圖6-A)。

**表示0.01水平上差異顯著; ns表示差異不顯著。

**P<0.01; ns, Not significantly different by Student’st-test.

圖2野生型與突變體的農(nóng)藝性狀對比

Fig. 2. Comparison of the agronomic traits of wild type Zhonghua 11 and mz3.

圖3突變基因的精細(xì)定位

Fig. 3. Fine mapping of the mutant gene.

3　討論

目前，不同的研究者通過不同的誘變方法獲得了多個水稻D3基因突變體[24-26]，它們的共同點是都表現(xiàn)出矮稈多分蘗。但由于誘變材料背景不同、基因發(fā)生突變的位點不同，表型也有一定的差異。如Ishikawa等[24]鑒定出的d3突變體籽粒變小，但枝梗數(shù)目、穗大小和小穗育性沒有明顯改變；段遠(yuǎn)霖等[25]鑒定出的det1突變體表現(xiàn)出明顯的生殖發(fā)育缺陷，如一、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)減少、籽粒變小且育性大幅下降。這些突變體的表型特征提示，D3在水稻生長發(fā)育的調(diào)解中具有多效性作用。本研究獲得的mz3突變體株高是野生型的61.8%(圖1)，分蘗數(shù)增加2.8倍，每穗粒數(shù)顯著減少，但結(jié)實率正常(圖2)。突變體的粒長、粒寬和粒厚均顯著下降，千粒重也因此顯著降低(圖2)。

A-突變體mz3的基因突變位點； B-10株隱性極端個體e1～e10測序結(jié)果。 ZH11，中花11(野生型)。

A， Mutation site ofmz3; B, Sequencing results of 10 extreme recessive individuals (e1-e10). ZH11, Zhonghua 11(wild type).

圖4候選基因的序列分析與后代驗證

Fig. 4. Sequence analysis of candidate gene and offspring validation.

A-野生型的D3蛋白定位在細(xì)胞核中； B-突變型的D3蛋白定位在細(xì)胞核中 (Bar=10 μm)。

A, D3 protein of wild type located in the nuclei; B, D3 protein of the mutant located in the nuclei (Bar=10 μm).

圖5D3蛋白的亞細(xì)胞定位

Fig. 5. Subcellular localization of D3 protein.

A-野生型的D3與D14能夠在核中結(jié)合； B-突變體的D3蛋白不能與D14蛋白在細(xì)胞核中發(fā)生互作; C-野生型的D3與p2YN空載體共轉(zhuǎn)化； D-突變體的D3與p2YN空載體共轉(zhuǎn)化； E-p2YC空載體與D14共轉(zhuǎn)化。(Bar=10 μm)

A, Wild type D3 can interact with D14 in the nuclei; B, Mutant D3 can not interact with D14 in the nucleus; C, Co-transformation of wild type D3 with empty p2YN vector; D, Co-transformation of mutant D3 with empty p2YN vector; E, Co-transformation of empty p2YC vector with D14. (Bar=10 μm).

圖6D3與D14的雙分子熒光互補分析

Fig. 6. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of D3 and D14.

D3基因編碼一個富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat)的F-box蛋白，與擬南芥的MAX2/ORE9 同源。F-box蛋白通常作為SCR類型E3連接酶的亞基，將底物蛋白多聚泛素化，由26S蛋白酶體將其降解。2013年我國兩個研究組同時在水稻中發(fā)現(xiàn)了D3的底物D53，它是獨腳金內(nèi)酯(SLs)信號途徑的抑制子[20-21]。由此，D3、D53和SLs的受體D14共同組成了水稻中SLs信號的關(guān)鍵因子。即當(dāng)SLs存在時，D14接收信號促使形成D53-D14-SCFD3復(fù)合體介導(dǎo)D53被26S蛋白酶體降解。D53降解后，SLs信號傳遞下去，發(fā)揮抑制水稻分蘗的功能；如果D53不能被降解，SLs信號阻斷，不能發(fā)揮抑制水稻分蘗的作用，引起多分蘗表型。因此，D3、D14和D53之間的互作是傳遞SLs信號的關(guān)鍵，其中D3和D14、D14和D53之間的互作依賴SLs的存在，而D3和D53的互作與SLs存在與否無關(guān)[20-21,26]。在本研究中，我們首先對野生型和mz3 突變體的D3進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明野生型的D3蛋白能定位在細(xì)胞核中(圖5)，這與前人的報道一致[20,26]。mz3 突變體的D3蛋白也能正確定位在細(xì)胞核中。進(jìn)一步通過BiFC證實，突變體的D3蛋白不能與D14發(fā)生互作，而相同條件下野生型的D3蛋白可以與D14互作(圖6)。這些結(jié)果說明，mz3 突變體中提前終止的D3基因編碼的截短蛋白保留了有功能的定位信號，使其能夠正確定位到細(xì)胞核中，但缺少能夠與D14蛋白發(fā)生互作的氨基酸序列，從而影響了其正常的生物學(xué)功能，造成突變表型。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of a Dwarf and High-tillering Mutant mz3 in Rice (Oryza sativa L.)

SU Xiao-mei1, FANG Yu-xing1, LIU Yu-long1, LIU Feng1, ZHANG Suo-bing2, ZHANG Yun-hui2,*, BAO Yi-qun1,*

(1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm/Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: baoyiqun@njau.edu.cn, zyhrice@163.com)

A dwarf and high-tillering mutant, temporarily termed asmz3 was obtained from Zhonghua 11, ajaponicarice variety by EMS mutagenesis. Genetic analysis indicated that the mutant phenotype was controlled by a recessive gene. An F2population was developed by crossingmz3 with Nanjing 11, anindicarice variety for mapping of the mutant gene, which was ultimately restricted within a physical distance of about 747 kb between two SSR markers RM19353 and RM510 on the long arm of rice chromosome 6. Gene prediction revealed thatD3, a gene conferring rice plant height and tiller number was located in this region. Sequence analysis identified a single G to A nuclear acid substitution at the position 636 from the ATG start codon, forming a premature translational termination codon. Sequencing of 10 randomly selected recessive plants frommz3/Nanjing 11 mapping population confirmed the same mutation site carried by the 10 individuals. Subcelluar location indicated that D3 protein of the mutant was located in the nuclei as wild type. BiFC analysis showed that D3 protein of the mutant could not interact with D14 protein for lacking of essential amino acids that bind with D14, blocking signal transduction of strigolactones. So we speculated that the mutant phenotype ofmz3 was probably caused by mutation inD3 gene.

rice; dwarf and high-tillering; D3; gene mapping

2016-03-04； 修改稿收到日期: 2016-05-02。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31401036)； 江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20130706)； 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助項目[(CX(14)5005)]； 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項[(ZX(15)4015)]。

Q343.5; Q511.032

A

1001-7216(2016)05-0479-08

蘇曉妹, 方宇星, 劉鈺龍, 等. 水稻矮稈多分蘗突變體mz3的遺傳分析和基因定位. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 479-486.