李怡鑫，陳向東，張雪寧，林孟杰，尤 麗，李 冉，軒慶慶，姜小苓，姜 豪，王潤(rùn)發(fā)，茹振鋼，吳曉軍

(河南科技學(xué)院小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

提高小麥產(chǎn)量對(duì)于全球糧食安全至關(guān)重要。株高是小麥重要農(nóng)藝性狀之一，對(duì)糧食產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大。20世紀(jì)60年代的“綠色革命”，育種工作者將矮稈或半矮稈基因引入小麥，顯著提高了抗倒伏能力和糧食收獲指數(shù)，小麥產(chǎn)量也得到大幅提高[1-2]。

迄今為止，被鑒定的小麥Rht矮稈基因共有25個(gè)[3-4]。根據(jù)對(duì)外源赤霉素的反應(yīng)，這些基因又被分為赤霉素敏感型和赤霉素不敏感型。對(duì)赤霉素不敏感的矮稈基因Rht-B1b(Rht1)和Rht-D1b(Rht2)，降低株高的能力相當(dāng)，一般能達(dá)到24%左右[5-6]；對(duì)赤霉素敏感的矮稈基因，如Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12和Rht13，通過縮短不同節(jié)間的長(zhǎng)度，使株高分別降低45%、50%、11%、24%、46%和24%[7-11]。Rht-B1b和Rht-D1b來源于日本農(nóng)林10號(hào)，Rht8來源于日本赤小麥[12-14]。一段時(shí)間以來，在我國(guó)小麥育種中應(yīng)用較為廣泛的矮稈基因主要有Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8[15-17]。這種情況造成了國(guó)內(nèi)矮稈基因利用單一化和小麥品種遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，不利于產(chǎn)量潛力的進(jìn)一步提高和小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。另外，在小麥育種中已經(jīng)被廣泛利用的Rht矮稈基因，雖然具有較強(qiáng)的抗倒伏能性和良好的肥水反應(yīng)，也顯著增加了糧食產(chǎn)量，但仍然存在一定缺點(diǎn)，如綜合農(nóng)藝性狀差、生產(chǎn)上利用困難等。因此，需要排除對(duì)農(nóng)藝性狀起負(fù)效作用的不利矮稈基因，尋找含有特定優(yōu)良矮稈基因且綜合性狀好的小麥新種質(zhì)，不斷拓寬小麥種質(zhì)遺傳資源。

為了解決國(guó)內(nèi)矮稈基因利用單一化和拓寬小麥種質(zhì)資源，本研究以47份外引小麥種質(zhì)為材料，利用與8個(gè)矮稈基因(Rht-B1b、Rht-D1b、Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12和Rht13)緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，鑒定外引種質(zhì)中矮稈基因的類型和分布特點(diǎn)，篩選出國(guó)內(nèi)利用較少且含有優(yōu)良矮稈基因的外引種質(zhì)材料，以期為有效利用外引小麥種質(zhì)和提高小麥育種成效提供一些理論依據(jù)和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

47份小麥種質(zhì)分別引自智利、美國(guó)、墨西哥、澳大利亞等10多個(gè)國(guó)家，其中11份材料(Kanto107、Manital、Opata、Glenlea、Madsen、Attila、Salmone、RL6077、Pavon、Pastor、Norin61)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所資源庫(kù)提供，其余材料由河南科技學(xué)院小麥中心提供。小麥品種中國(guó)春(China Spring，CS)不含本研究所檢測(cè)的矮稈基因[18]，作為對(duì)照。

1.2 方 法

1.2.1 田間小麥株高的測(cè)量

小麥材料分別種植于河南科技學(xué)院朗公廟試驗(yàn)田和輝縣試驗(yàn)田，每個(gè)品種(系)種植2行，行長(zhǎng)4 m，行距20 cm，株距10 cm，試驗(yàn)地肥力均一，采用常規(guī)田間管理。在小麥灌漿期至成熟期測(cè)量株高，每個(gè)材料隨機(jī)測(cè)量5株，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 DNA提取及分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB法提取小麥基因組總DNA，將DNA稀釋至100 mg·μL-1，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所用檢測(cè)引物參照Ellis等[19-20]和Korzun等[21]，提供的引物序列由上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司合成，引物信息詳見表1。

表1 矮稈基因引物信息Table 1 Primer information of dwarf genes

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×Taq Master Mix(購(gòu)至北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、10 μmol·L-1的正反向引物 0.6 μL、100 ng·μL-1的 DNA模板1 μL、ddH2O 7.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性40 s，52～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。Rht1和Rht2擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳檢測(cè)；Rht4、Rht5、Rht9、Rht12和Rht13擴(kuò)增產(chǎn)物使用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；Rht8擴(kuò)增產(chǎn)物使用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.05進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 47份外引小麥種質(zhì)中8個(gè)矮稈基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

Rht1基因的多態(tài)性有兩種，包括野生型(Rht-B1a)和突變型(Rht-B1b)，其中，Rht-B1b表現(xiàn)為矮稈表型。利用兩對(duì)引物BF/WR1和BF/MR1對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，如果小麥種質(zhì)中含有Rht-B1a基因，BF/WR1可以擴(kuò)增出237 bp的條帶，而BF/MR1無擴(kuò)增條帶；如果小麥種質(zhì)種含有Rht-B1b基因，則BF/WR1無擴(kuò)增條帶，而BF/MR1可以擴(kuò)增出237 bp的條帶。本研究中，用不含所檢測(cè)矮稈基因的小麥品種中國(guó)春為對(duì)照，BF/MR1引物擴(kuò)增結(jié)果顯示沒有237 bp條帶，說明擴(kuò)增結(jié)果可靠(圖1)。檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，47份外引材料中只含Rht-B1b單個(gè)矮稈基因的材料有2份，含有Rht-B1b或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有19份，占40.43%。

Rht2基因的野生型為Rht-D1a(264 bp)，突變型為Rht-D1b(254 bp)，Rht-D1b表現(xiàn)為矮稈表型。利用兩對(duì)引物DF2/WR2和DF/MR2對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，在含有Rht-D1a的小麥種質(zhì)中，引物DF/MR2無擴(kuò)增目的條帶，而DF2/WR2則能擴(kuò)增出264 bp的條帶；在含有Rht-D1b的小麥種質(zhì)中，DF/MR2可以擴(kuò)增出254 bp的條帶，而DF2/WR2無目的條帶。47份外引小麥種質(zhì)檢測(cè)結(jié)果(圖1，表2)顯示，沒有發(fā)現(xiàn)只含Rht-D1b單個(gè)矮稈基因的材料，同時(shí)含有Rht-D1b矮稈基因的材料有9份，占 19.15%。

根據(jù)Korzun等[21]設(shè)計(jì)的Rht8基因分子標(biāo)記，利用引物Xgwm261-F/R對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，如擴(kuò)增出192 bp的目的條帶，則表明小麥種質(zhì)中含有Rht8矮稈基因。檢測(cè)結(jié)果(圖1，表2)顯示，47份外引材料中，只含Rht8單個(gè)矮稈基因的材料有3份，含有Rht8或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有15份，占31.91%。

根據(jù)Ellis等[20]設(shè)計(jì)的Rht4、Rht5、Rht9、Rht12和Rht13基因分子標(biāo)記，分別利用引物WMC317-F/R、BARC102-F/R、BARC151-F/R、WMC410-F/R和WMS577-F/R對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖1，表2)顯示，47份外引材料中，只含Rht4單個(gè)矮稈基因的材料有1份，含有Rht4或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有19份，占40.43%(圖1、表2)；只含Rht5單個(gè)矮稈基因的材料有2份，含有Rht5或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有4份，占8.51%(圖1、表2)；沒有發(fā)現(xiàn)只含Rht9單個(gè)矮稈基因的材料，同時(shí)含有Rht9矮稈基因的材料有3份，占6.38%(圖1、表2)；只含Rht12單個(gè)矮稈基因的材料有2份，含有Rht12或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有19份，占40.43%(圖1、表2)；沒有發(fā)現(xiàn)只含Rht13單個(gè)矮稈基因的材料，同時(shí)含有Rht13矮稈基因的材料有9份，占19.15%(圖1、表2)。

M1：DNA marker DL2000；M2：50 bp DNA ladder；1：中國(guó)春；2：薩爾斯堡；3：澳阿優(yōu)1號(hào)；4：阿大學(xué)AGT-②；5：KPL-1；6：鳥麥；7：KPL-6；8：KPL-7；9：KPL-11；10：Rudu。箭頭所示為目標(biāo)片段。

2.2 47份外引小麥種質(zhì)中矮稈基因的分布及降稈效應(yīng)

由表2和表3可知，47份外引小麥種質(zhì)中有46份含有矮稈基因，占比接近98%。不同矮稈基因及其組合對(duì)小麥的降稈效應(yīng)不同，單個(gè)矮稈基因的降稈效應(yīng)不一定低于含有該基因的矮稈基因組合，不含矮稈基因的小麥材料株高顯著高于含有矮稈基因的小麥材料。以不含8個(gè)矮稈基因的外引種質(zhì)“非黑土地24”平均株高為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各矮稈基因及其組合的降稈效應(yīng)，結(jié)果顯示，降稈效應(yīng)達(dá)到30%以上的矮稈基因組合有Rht-B1b/Rht8/Rht13(42.22%)、Rht4/Rht5(41.33%)、Rht-D1b/Rht4/Rht5/Rht12(38.37%)、Rht-B1b/Rht8(37.56%)、Rht-B1b/Rht4/Rht13(37.48%)、Rht-D1b/Rht4/Rht12(36.37%)、Rht-B1b/Rht4(35.41%)、Rht4/Rht12(34.22%)、Rht-B1b/Rht12/Rht13(33.26%)、Rht-B1b/Rht-D1b/Rht4/Rht12(32.44%)、Rht-B1b/Rht12(30.67%)、Rht4/Rht13(30.07%)，8個(gè)矮稈基因中Rht5單個(gè)矮稈基因的降稈效應(yīng)也達(dá)到了30%以上。

47份外引小麥種質(zhì)中含有Rht-B1b、Rht-D1b、Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12、Rht13單個(gè)矮稈基因的材料分別有2、0、1、2、3、0、2、0，共占總數(shù)的21.28%。含有2個(gè)及以上矮稈基因的材料占76.60%，其中含有2個(gè)矮稈基因的材料有23份，占48.94%，含有3個(gè)矮稈基因的材料有11份，占23.40%，含有4個(gè)矮稈基因的材料有2份，占4.26%。

47份外引小麥種質(zhì)中8個(gè)矮稈基因的分布頻率高低依次為Rht4=Rht12=Rht-B1b(40.43%)>Rht8(31.91%)>Rht-D1b(19.15%)=Rht13(19.15%)>Rht5(8.51%)>Rht9(6.38%)。含有這8個(gè)矮稈基因的小麥種質(zhì)在株高上差異顯著，降稈效應(yīng)最低的為Rht9，平均株高101.07 cm；其次為Rht8，平均株高 95.67 cm，Rht12和Rht13降稈效應(yīng)差異較小，分別為92.87 cm和92.75 cm，Rht-B1b、Rht-D1b、Rht4的降稈效應(yīng)差異較小，分別為90.69 cm、 91.45 cm、91.98 cm，降稈效應(yīng)最高的為Rht5，平均株高為86.65 cm(表2，表3)。

表2 8種矮稈基因及其組合的對(duì)株高的影響Table 2 Effect of eight dwarf genes and their combinations on plant height

表3 47份外引種質(zhì)中矮稈基因類型及株高表現(xiàn)Table 3 Dwarf genotypes and plant height performance of 47 introduced germplasms

3 討 論

矮稈或半矮稈基因應(yīng)用于小麥育種，能夠提高小麥的抗倒性和收獲指數(shù)，對(duì)于提高小麥產(chǎn)量具有重要意義[22-24]。一直以來，我國(guó)小麥育種圍繞少數(shù)骨干親本來培育新品種，造成小麥遺傳基礎(chǔ)狹窄，也加大了培育突破性品種的難度。程西永等[25]對(duì)來自中國(guó)、智利、俄羅斯、墨西哥、澳大利亞、荷蘭的728份小麥種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)小麥種質(zhì)資源具有早熟、高粒重和植株矮的優(yōu)點(diǎn)，而俄羅斯小麥分蘗成穗多，智利小麥穗粒數(shù)高，墨西哥小麥面粉吸水率高，荷蘭小麥抗白粉病性好，說明從外國(guó)引進(jìn)的這些小麥種質(zhì)資源可以有效改良我國(guó)小麥的農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和抗病性。本研究中47份小麥種質(zhì)分別引自墨西哥、智利、澳大利亞、美國(guó)、日本、俄羅斯等多個(gè)國(guó)家，抗病性遺傳類型豐富，含有抗赤霉病、抗銹病、抗白粉病等基因，如澳阿優(yōu)1號(hào)和bermude兼具條銹病和白粉病抗性[26]。其中，含有優(yōu)異矮稈，或其他優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因的種質(zhì)材料，可以適當(dāng)應(yīng)用到我國(guó)小麥育種中。

鐘明志等[27]研究表明，Rht-B1b、Rht-D1b、Rht9和Rht13的降稈能力相當(dāng)，降稈效應(yīng)均在24%左右，其他矮稈基因的降稈能力表現(xiàn)為Rht5(50%)>Rht12(46%)>Rht4(45%)>Rht8(11%)。本研究中單個(gè)矮稈基因的降稈效應(yīng)以Rht5最強(qiáng)，為31.78%，也是單個(gè)矮稈基因里唯一降稈效應(yīng)達(dá)到30%以上的。李杏普等[22]研究表明，Rht12基因在顯著降低株高的同時(shí)會(huì)促進(jìn)小穗發(fā)育和提高穗粒數(shù)，也會(huì)造成生物產(chǎn)量降低、成熟晚等，但在以降稈為主要目的的育種中利用價(jià)值較大。本研究中含有Rht12單個(gè)矮稈基因的材料有2份，分別是Brennan和KPL-5，平均降稈效應(yīng)只達(dá)到 18.96%，低于Rht8的降稈效應(yīng) (24.45%)；有19份材料含有Rht12基因，占材料總數(shù)的40.43%，平均降稈效應(yīng)為31.21%，遠(yuǎn)低于鐘明志等[27]研究中Rht12的降稈效果。另外，還發(fā)現(xiàn)一些矮稈基因組合的降稈效應(yīng)反而比單個(gè)矮稈基因弱，如Rht8單個(gè)矮稈基因的降稈效應(yīng)為 24.45%，而Rht8/Rht12、Rht8/Rht13基因組合的降稈效應(yīng)為18.67%和21.63%。造成以上現(xiàn)象的原因可能有三個(gè)，一是所檢測(cè)小麥種質(zhì)數(shù)量較少，二是除這8個(gè)矮稈基因外，還可能存在其他矮稈基因，三是株高為復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多種因素影響，引進(jìn)的國(guó)外種質(zhì)在新的生長(zhǎng)環(huán)境中株高等性狀表現(xiàn) 異常。

在矮稈基因應(yīng)用方面，我國(guó)推廣小麥品種含有的矮稈基因主要為Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8等少數(shù)類型，而其他矮稈基因則利用較少[15-17]。除此之外，還有一些頗具應(yīng)用潛力的矮稈基因，如Rht9在降稈的同時(shí)會(huì)減少小穗長(zhǎng)度，增加分蘗數(shù)和千粒重，最終提高糧食產(chǎn)量[8]；Rht12在顯著降低株高的同時(shí)提高穗粒數(shù)，從而提高產(chǎn)量[10,22]；Rht13對(duì)赤霉素敏感，在降低株高的同時(shí)不影響胚芽鞘長(zhǎng)度和幼苗長(zhǎng)勢(shì)，而且可以顯著提高穗粒數(shù)、增加糧食產(chǎn)量[24]。在本研究檢測(cè)的47份外引種質(zhì)材料中，未發(fā)現(xiàn)含有Rht9單個(gè)矮稈基因的材料，同時(shí)含有Rht9的材料共有3份，占材料總數(shù)的6.38%；未發(fā)現(xiàn)含有Rht13單個(gè)矮稈的材料，同時(shí)含有Rht13的材料共有9份，占材料總數(shù)的19.15%；含有Rht9、Rht12、Rht13的材料共有28份，占總數(shù)的59.57%，可以利用這些種質(zhì)材料與國(guó)內(nèi)品種組配，培育出廣適性的小麥中間材料。47份外引種質(zhì)出也含有降稈效果好而產(chǎn)量性狀表現(xiàn)一般的矮稈基因，如Rht4、Rht5[27]。47份種質(zhì)材料中，含有Rht4單個(gè)矮稈基因的材料有1份，含有Rht4或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有19份，占材料總數(shù)的40.43%；含有Rht5單個(gè)矮稈基因的材料有2份，含有Rht5或同時(shí)含有其他矮稈基因的材料有4份，占8.51%；其中，Rht4、Rht5與有應(yīng)用潛力矮稈基因共存的材料有13份。47份外引種質(zhì)矮稈基因類型和分布的明確，有利于在育種中排除某些農(nóng)藝性狀表現(xiàn)不良的矮稈基因(Rht4、Rht5)，增加優(yōu)良矮稈基因Rht9、Rht12、Rht13的育種利用，從而拓寬小麥矮稈育種遺傳基礎(chǔ)。另外，在8個(gè)矮稈基因中，除Rht12為顯性遺傳外，其余基因均為隱性遺傳[27]，而隱性遺傳矮稈基因在小麥育種的早代進(jìn)行選擇相對(duì)困難，因此，利用分子標(biāo)記進(jìn)行早代輔助選擇，有利于提高小麥育種效率。

本研究利用8個(gè)矮稈基因分子標(biāo)記對(duì)47份外引種質(zhì)材料的矮稈基因類型及分布頻率進(jìn)行了鑒定，明確了Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8三個(gè)主要矮稈基因的分布頻率，篩選出含Rht9、Rht12、Rht13有應(yīng)用潛力矮稈基因的種質(zhì)材料28份，為國(guó)內(nèi)矮稈高產(chǎn)小麥品種選育提供了一些理論依據(jù)和材料支撐。