劉美玲，劉 悅，陳婷婷，龔雙軍，史文琦，曾凡松，楊立軍，喻大昭

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)作物重大病蟲(chóng)草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064)

小麥赤霉病是一種世界范圍內(nèi)危害極重的流行病害，隨著全球氣溫升高、秸稈還田的普及以及免耕技術(shù)的推廣，小麥赤霉病在全球各小麥產(chǎn)區(qū)呈迅速擴(kuò)張趨勢(shì)[1]，在近些年份造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)、品質(zhì)下降，且會(huì)使感病麥粒分泌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等毒素[2-3]，間接引發(fā)食品安全問(wèn)題。2018年，我國(guó)小麥赤霉病發(fā)病面積 5.7×106hm2，超過(guò)小麥播種總面積的三分之一，其中湖北省發(fā)病面積超過(guò)40%[3]；2012年，我國(guó)小麥赤霉病流行區(qū)約發(fā)生面積9.3×106hm2[4]。2015 和 2016 兩年全球赤霉病平均造成小麥產(chǎn)量損失7.35×108t，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1.45億美元[5]。另外，病原菌還能產(chǎn)生多種真菌毒素，危害人畜健康及食品安全[6-7]，因此受到世界相關(guān)學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

小麥赤霉病由多種鐮孢菌致病種引起，其中禾谷鐮孢菌(F.graminearumsensu strict)是優(yōu)勢(shì)致病種。禾谷鐮孢菌是一個(gè)進(jìn)化宗系群，早在2008年就被分離和鑒定出24個(gè)種的鐮孢菌[8]。致病種在不同地域麥區(qū)之間差異明顯，華北、西北、黃淮流域及其以北麥區(qū)F.graminearum為優(yōu)勢(shì)致病種群；而長(zhǎng)江中下游麥區(qū)F.asiaticum為優(yōu)勢(shì)致病種群[9-11]。赤霉病菌主要產(chǎn)生B型單端孢霉烯族(trichothecene)毒素，此類(lèi)毒素主要分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)兩類(lèi)真菌毒素，其中DON又可進(jìn)一步細(xì)分為3-ADON、15-ADON兩種衍生物毒素[12]。溫、濕度等氣象條件、多樣的種植方式在較大程度上影響著病原菌的地理分布[13]；此外，不同的小麥栽培品種和不同的輪作制度也與病原菌類(lèi)型有著很大的關(guān)系[14]，如Lee等[15-16]研究表明，在朝鮮水稻-小麥輪作區(qū)的赤霉病菌以F.asiaticum為主，而玉米-小麥輪作區(qū)的赤霉病菌以F.graminearum為主。研究發(fā)現(xiàn)，小麥-玉米輪作田赤霉病發(fā)生較重，而將輪作植物由玉米換成大豆后赤霉病感染率顯著下降；在常年種植非禾谷類(lèi)農(nóng)作物的大田中很難分離到赤霉病菌[17]?？紤]到湖北小麥主產(chǎn)區(qū)以玉-麥輪作和稻-麥輪作為主，本研究擬在湖北襄陽(yáng)主產(chǎn)麥區(qū)的襄州區(qū)和棗陽(yáng)市分別選擇長(zhǎng)期水稻-小麥和玉米-小麥輪作田塊取樣分析，以明確不同輪作方式對(duì)小麥赤霉病菌種群和毒素化學(xué)類(lèi)型的影響，為赤霉病的大田防治決策提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和分離

2019和2020 兩年度從湖北省襄陽(yáng)市襄州區(qū)和棗陽(yáng)市不同輪作模式田塊于小麥灌漿期分別采集小麥赤霉病病穗樣品，其中，采樣點(diǎn)襄州區(qū)原種場(chǎng)、牛首鎮(zhèn)以及棗陽(yáng)市太平鎮(zhèn)為玉-麥輪作田塊，襄州區(qū)張家集鎮(zhèn)何崗村、棗陽(yáng)市吳店鎮(zhèn)蔣莊村為稻-麥輪作田塊。每個(gè)采樣田塊棋盤(pán)式隨機(jī)取 15～20株具有明顯發(fā)病癥狀的小麥穗，用信封袋裝好編號(hào)。采用組織分離法進(jìn)行分離，即將小麥病穗的病健交接處剪成1～2 cm的短節(jié)，先置于2%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒1 min，再用75%酒精消毒1 min,無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后將樣品置于含100 ug·mL-1硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，獲得各分離物。

1.2 分離物形態(tài)學(xué)初步鑒定、菌株單孢純化與 保存

鐮孢菌的初步形態(tài)學(xué)鑒定是以分離物在PDA培養(yǎng)基上菌落顏色和形態(tài)以及在綠豆培養(yǎng)基中產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)等為依據(jù)[18-19]。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后有綿白色細(xì)長(zhǎng)菌絲，3 d后PDA培養(yǎng)基出現(xiàn)淺洋紅色，7 d后菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樽霞t色，顏色呈輻射狀由深到淺，即可初步判定其為鐮孢菌。將這些初步鑒定為鐮孢菌的分離物，用直徑1 cm的打孔器打菌餅接種至5%的綠豆汁培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中26 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)3 d；將鏡檢能觀察到大量中間有隔的鐮刀狀分生孢子稀釋到1×103個(gè)·mL-1；將3%水瓊脂用滅菌刀片分割成邊長(zhǎng)3 mm的小塊，點(diǎn)接1 μL孢子液，在顯微鏡16×10視野下觀察，挑取只有一個(gè)孢子的水瓊脂塊。將該瓊脂塊移動(dòng)到PDA培養(yǎng)基中， 25 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取菌絲塊于50%甘油中，-70 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3 鐮孢菌致病種的分子鑒定

采用DNA試劑盒(Omega Bio-Tek公司)提取篩選的鐮孢菌株基因組DNA。DNA用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用引?Fg16F/R對(duì)提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中F.asiaticum擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 500 bp，F(xiàn).graminearum擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 400 bp[20]。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃ +∞。試驗(yàn)用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物均用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、照相。

1.4 鐮孢菌毒素化學(xué)型的鑒定

采用引物3CON、3NA、3D15A和 3D3A進(jìn)行PCR檢測(cè)，根據(jù)帶型大小區(qū)分所產(chǎn)毒素的類(lèi)型[28]，其中，產(chǎn) NIV毒素?cái)U(kuò)增產(chǎn)物為 840 bp，產(chǎn) 15ADON 毒素為 610 bp，產(chǎn) 3ADON 毒素為 243 bp(圖2)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃ +∞。試驗(yàn)用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪作模式下小麥赤霉病菌種群結(jié)構(gòu)

通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，共從湖北省襄陽(yáng)市、棗陽(yáng)市稻-麥輪作田和玉-麥輪作田分離出191株赤霉病菌，通過(guò)PCR對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，玉-麥輪作田共分離菌株62株，F(xiàn).graminearum占62.90%，F(xiàn).asiaticum占37.10%；稻-麥輪作田分離菌株129株，F(xiàn).graminearum占6.98%，F(xiàn).asiaticum占93.02%。說(shuō)明玉-麥輪作田優(yōu)勢(shì)種是F.graminearum，稻-麥輪作田優(yōu)勢(shì)種是F.asiaticum。

表2 供試菌株的來(lái)源、種群類(lèi)型Table 2 Sources and species composition of the tested strains

M: 100 bp DNA ladder; 1～5:分離菌株 Isolated strains

2.2 不同輪作模式下小麥赤霉病鐮孢菌致病種與毒素化學(xué)型的關(guān)系

通過(guò)PCR檢測(cè)NIV、3-AcDON、15-AcDON結(jié)果如表3所示。191株赤霉病菌中,11株產(chǎn)生NIV毒素，180株產(chǎn)生DON毒素;兩種輪作模式均以產(chǎn)生DON毒素為主。稻-麥輪作田中，共檢測(cè)到120個(gè)菌株產(chǎn)DON毒素，其中87.50%產(chǎn)生3-AcDON毒素，12.50%產(chǎn)生15-AcDON毒素。玉-麥輪作田中，共檢測(cè)到60個(gè)菌株產(chǎn)DON毒素，其中31.67%產(chǎn)生3-AcDON毒素，68.33%產(chǎn)生15-AcDON毒素。稻-麥輪作田中，F(xiàn).asiaticum以3-AcDON為主，占比86.67%；F.graminearum以15-AcDON為主，占比66.67%。玉麥輪作田中，F(xiàn).asiaticum主要產(chǎn)生3-AcDON，占65.22%；F.graminearum既可能產(chǎn)生15-AcDON又可能產(chǎn)生3-AcDON。

表3 191株鐮孢菌菌的來(lái)源、類(lèi)型及其產(chǎn)毒素類(lèi)型Table 3 Source of the 191 Fusarium，species and toxin chemical types strains

M: DL2000;1～10:產(chǎn)毒素樣品 Samples of toxigenic

3 討 論

多種鐮孢菌可以引起小麥赤霉病，赤霉病菌優(yōu)勢(shì)種因地區(qū)及不同輪作方式而異。Qu等[21]和Zhang等[22]研究認(rèn)為，赤霉病菌種群分布受氣溫、緯度影響，年平均氣溫低于15 ℃緯度高的涼爽省份以F.graminearum種群占比較大，而年平均氣溫高于15 ℃緯度低的省份以F.asiaticum種群占比較大。然而，溫度并不是影響小麥赤霉病菌種群分布的決定因素，小麥的不同輪作方式對(duì)鐮孢菌種群的分布影響更大。方興州等[23]和Lee等[24]的研究表明，水稻-小麥輪作區(qū)F.asiaticum是主要的優(yōu)勢(shì)群體，玉米-小麥輪作區(qū)F.graminearum是主要的優(yōu)勢(shì)群體。盧麗斌[25]研究發(fā)現(xiàn)，安徽省同一經(jīng)緯度、同一氣候條件下，不同前茬作物對(duì)對(duì)鐮孢菌種群具有明顯影響。本研究中，襄陽(yáng)和棗陽(yáng)所選擇的水稻-小麥和玉米-小麥輪作區(qū)的取樣點(diǎn)分別只有10 km左右距離，平均氣溫、緯度相差不大，發(fā)現(xiàn)在玉米-小麥輪作區(qū)，鐮孢菌分離株中F.graminearum的占比為66.67%，在水稻-小麥輪作區(qū)，鐮孢菌分離株中F.asiaticum占比高達(dá)90%以上。與盧麗斌[25]結(jié)論一致。不同輪作方式對(duì)赤霉病菌優(yōu)勢(shì)種的影響可能與病原菌對(duì)前茬作物的偏好性有關(guān)。F.graminearum相對(duì)于鐮孢菌的其他種對(duì)玉米具有寄主偏好性，稻茬對(duì)F.asiaticum具有一定的選擇作用[26]。本研究結(jié)果表明，湖北省小麥赤霉病菌F.asiaticum和F.graminearum的分布與種植模式顯著相關(guān)。

小麥赤霉病不僅影響其產(chǎn)量，更重要的是染病麥粒含有多種赤霉毒素，危害人畜健康，引發(fā)糧食安全問(wèn)題。在一年一熟的水稻種植區(qū)，F(xiàn).asiaticum主要產(chǎn)生NIV毒素[27-28]。在本研究中，產(chǎn)生毒素的差異可能是小麥對(duì)產(chǎn)生3-AcDON毒素的F.asiaticum選擇而造成。我國(guó)長(zhǎng)江中下游麥區(qū)是世界上唯一的一年兩熟大范圍稻-麥輪作區(qū)，赤霉病菌種群經(jīng)過(guò)了水稻和小麥的選擇，產(chǎn)生3-AcDON毒素的F.asiaticum在水稻和小麥上適應(yīng)性強(qiáng)逐漸成為優(yōu)勢(shì)種，而一年一熟的水稻種植區(qū)沒(méi)有小麥選擇的壓力，NIV又對(duì)水稻具有偏好性，因而成為優(yōu)勢(shì)種[26，29]。本研究中，湖北稻-麥輪作區(qū)F.asiaticum以產(chǎn)生3-AcDON毒素為主，僅檢測(cè)到少量的NIV菌株，這與前人報(bào)道結(jié)論一致[10-11]，玉-麥輪作區(qū)15-AcDON毒素比例的上升與分離到的F.graminearum菌株上升有關(guān)。報(bào)道楊美欣[29]，產(chǎn)DON(3ADON和15ADON)的F.g和F.a菌株致病力要高于產(chǎn) NIV的F.a菌株，這也說(shuō)明湖北省相對(duì)于四川省小麥赤霉病重發(fā)的一個(gè)原因。本研究認(rèn)為，湖北小麥赤霉病菌的種群組成與毒素化學(xué)型存在一定的相關(guān)性。除受溫度、不同輪作模式等影響之外，不同生態(tài)區(qū)赤霉病菌毒素化學(xué)型的分布是否還受土壤、地質(zhì)等其他因素影響尚需進(jìn)一步研究。