朱艷梅,宮　曉,郭偉偉,徐保娟,李陸梅,郎　楓,劉紅祥,劉　東,范根成

(動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114)

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2012年—2015年我國(guó)部分地區(qū)禽偏肺病毒的分子流行病學(xué)分析

朱艷梅,宮曉,郭偉偉,徐保娟,李陸梅,郎楓,劉紅祥,劉東,范根成*

(動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114)

為了調(diào)查雞群中禽偏肺病毒(aMPV)的流行情況，本研究從江蘇、遼寧、河南、山東、河北等地有腫頭癥狀的雞群中取其鼻甲骨和鼻黏液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，隨機(jī)選取9株P(guān)CR陽(yáng)性產(chǎn)物對(duì)其F基因進(jìn)行序列測(cè)定與遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，280份病料中檢出陽(yáng)性樣品142份，陽(yáng)性檢出率達(dá)50.7%；9個(gè)試驗(yàn)毒株之間F基因同源性為99.4%～100%，與B型aMPV代表株的同源性為97.7%～99.9%，而與A型、C型和D型aMPV代表株的同源性為71.9%～79.4%；由遺傳進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)，這9株aMPV均屬于B型分支。說(shuō)明我國(guó)雞群中目前存在aMPV感染，B型毒株是優(yōu)勢(shì)流行基因型，從而為禽偏肺病毒疫苗的開(kāi)發(fā)提供了流行病學(xué)資料。

禽偏肺病毒；流行病學(xué)；F基因；同源性

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，aMPV)屬于副黏病毒科、肺病毒屬，是引起雞腫頭綜合征的主要病原，其基因組含有8個(gè)片段，分別為N、P、M、F、M2、SH、G、L[1]，根據(jù)基因差異和血清學(xué)分析，aMPV分為A、B、C、D 4個(gè)亞型，其中F蛋白是主要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，具有吸附作用，是重要的毒力蛋白和保護(hù)性抗原[2-3]。自1978年aMPV首次在南非發(fā)現(xiàn)以后，俄羅斯、巴西、以色列、日本以及大多數(shù)的歐洲國(guó)家等地區(qū)均有報(bào)道，呈世界范圍流行[4]。該病傳染性強(qiáng)，傳播迅速，能引起多種禽類(lèi)感染發(fā)病并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)沈瑞忠等[5]1998年在黑龍江某肉雞場(chǎng)的腫頭綜合征雞群中分離到禽偏肺病毒。該病毒主要引起雞的腫頭綜合征，以眶下竇腫脹、頭部腫脹、打噴嚏、流鼻涕和產(chǎn)蛋率下降等癥狀為主要特征，感染率可高達(dá)100%，病死率隨飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件而變化，若有混合感染，病死率可高達(dá)25%～40%[6]。2012年—2015年期間，從江蘇、遼寧、河南、山東、河北等地有腫頭癥狀雞群中取其鼻甲骨和鼻黏液提取RNA，利用RT-PCR對(duì)aMPV F蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，旨在闡明aMPV在我國(guó)部分地區(qū)的流行狀況，為制定禽偏肺病毒防控措施提供可靠依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料2012年—2015年期間，采集自江蘇、遼寧、河南、山東、河北5個(gè)省份雞場(chǎng)中有腫頭癥狀的病料共計(jì)280份。

1.1.2試劑 柱式動(dòng)物病毒RNAout 提取試劑盒，北京天恩澤生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL 2 000等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；pGEM-T easy Vector，Promega公司產(chǎn)品；Ampicilin、X-gal、IPTG，Sigma公司產(chǎn)品；Agarose Gel DNA Purification kit (ver.2.0)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1雞只剖檢及病料采集從江蘇、遼寧、河南、山東、河北地區(qū)有腫頭癥狀雞群中采集其鼻甲骨和鼻黏液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2F蛋白基因序列測(cè)定

1.2.2.1引物設(shè)計(jì)參照GenBank已公布的aMPV F蛋白基因片段核苷酸序列，采用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增aMPV F基因的特異性引物，上游引物為：APVF-F：5′-ATTAGGCAATGGCGTTCGCA-3′；下游引物為：APVF-R：5′-CTCCACCTCTGATGCAACAT-3′。引物由上海Sangon有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為590 bp。

1.2.2.2病毒RNA提取和F基因的擴(kuò)增取250 μL病料懸液，按照柱式動(dòng)物病毒RNAout提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)流程提取病毒基因組RNA。用APVF-F和APVF-R引物進(jìn)行一步法RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)； 72℃ 7 min；12℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2.3F基因的克隆和序列分析PCR產(chǎn)物回收按Agarose Gel DNA Purification Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將純化后的產(chǎn)物按pGEM-T easy Vector說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，經(jīng)AIX平板篩選陽(yáng)性克隆。挑取2個(gè)～3個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。用Megalign和Mega5.0軟件對(duì)測(cè)定的aMPV F蛋白基因序列與GenBank中部分代表性毒株序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。

1.2.3統(tǒng)計(jì)分析對(duì)不同日齡、品種和省份的雞群病料，統(tǒng)計(jì)PCR陽(yáng)性率。

2　結(jié)果

2.1病雞癥狀和剖檢變化

發(fā)病雞腫臉腫頭，精神沉郁，排黃綠色稀糞(圖1A)；剖檢的雞可見(jiàn)頭部皮下、眼眶周?chē)M織呈膠凍樣浸潤(rùn)，后期呈黃色疏松硬實(shí)的腫塊(圖1B)；部分病雞頭部和肉髯、肉冠的皮下組織，頭蓋骨的氣室和中耳出現(xiàn)肉芽腫和纖維素性化膿性炎癥，嚴(yán)重者出現(xiàn)氣管炎甚至肺壞死(圖1C)；腹部出現(xiàn)急性卵黃性腹膜炎，腹部可見(jiàn)蛋黃和破碎蛋殼(圖1D)。

A.頭部；B.皮下；C.氣管；D.卵黃性腹膜炎

A.Head;B.Subcutaneous;C.Trachea;D.Yolk peritonitis

圖1臨床發(fā)病雞剖檢變化

Fig.1The autopsy pictures of clinically infected chicken

2.2病料RT-PCR檢測(cè)情況

對(duì)采集的樣品處理后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示，樣品中(3、4、5、6)檢測(cè)到目的條帶，與預(yù)期片段大小(590 bp)相符(圖2)。將PCR產(chǎn)物克隆于pGEM-T easy Vector中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。對(duì)我國(guó)部分地區(qū)有腫頭癥狀的280份病料進(jìn)行RT-PCR鑒定，其中有142份樣品中可擴(kuò)增出590 bp左右的片段，陽(yáng)性檢出率為50.7%(表1)。將測(cè)序結(jié)果與GenBank比對(duì)后，結(jié)果均為禽偏肺病毒。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陽(yáng)性對(duì)照; 2.健康雞組織對(duì)照;3～6.被檢測(cè)樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1.Positive control;2.Tissue of healthy chicken;3-6.Tested samples

圖2分離株的RT-PCR鑒定

Fig.2RT-PCR identification of strains isolated

2.3統(tǒng)計(jì)分析

由表1可以看出，這5個(gè)地區(qū)發(fā)病雞群陽(yáng)性率均在40%～64%，差異不明顯； 但從日齡上看，150日齡～300日齡的產(chǎn)蛋雞陽(yáng)性率明顯高于150日齡以?xún)?nèi)的產(chǎn)蛋雞；從品種上看，肉種雞的陽(yáng)性率明顯高于蛋雞，其中150日齡～300日齡的肉種雞陽(yáng)性率最高，發(fā)病肉種雞在產(chǎn)蛋期的PCR陽(yáng)性率甚至高達(dá)100%，說(shuō)明肉種雞在產(chǎn)蛋期較易感。

2.4aMPV F蛋白基因核苷酸序列同源性分析

從不同地區(qū)RT-PCR陽(yáng)性樣品中隨機(jī)選取9個(gè)試驗(yàn)毒株 F基因的核苷酸進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，試驗(yàn)毒株之間F基因同源性為99.4%～100%；與2株2010年的B型中國(guó)代表株的同源性在99.4%～99.9%之間，與B型意大利株(歐洲株)aMPV/B/IT/Guineafowl/1818/12(gb:KC542808)同源性在97.6%～97.9%之間；而與A型代表株LAH A(gb:AY640317)、 C型代表株GDY(gb:KC915036)、Colarado(gb:AY590688)、France(gb:HG934338)、MN(gb:FJ977568)、D型代表株Fr85.1(gb:HG934339)同源性較低，為72.4%～79.3%。結(jié)果顯示，這9株分離株均為B型aMPV，并且F基因變異較小(表2)。

2.5F蛋白基因的遺傳進(jìn)化分析

利用Mega5.0對(duì)代表株的F蛋白基因進(jìn)行序列比較，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，同樣可以看出這9株aMPV均分布在B型分支上(圖3)，說(shuō)明B型aMPV是我國(guó)主要流行毒株。

表1　病料RT-PCR陽(yáng)性檢測(cè)率Table 1　 The positive rate of samples by RT-PCR

表2　aMPV F基因部分序列同源性分析Table 2　The homology analysis of F gene sequence of avian metapneumovirus

注：1～9為本試驗(yàn)分離株；10～18為各亞型代表株。

Note:1-9.The isolated strains of this experiment;10-18.The representative strains of each subtype.

圖3　禽偏肺病毒F蛋白基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

3　討論

目前許多國(guó)家對(duì)禽偏肺病毒均有報(bào)道，尤其是火雞飼養(yǎng)國(guó)家如美國(guó)、墨西哥[7]、埃及[7-8]等，已成為造成家禽呼吸道和產(chǎn)蛋下降的主要病原之一。在國(guó)內(nèi)，郭龍宗等在膠東地區(qū)對(duì)種雞群進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)禽偏肺病毒感染是普遍存在的，多個(gè)雞群的血清學(xué)陽(yáng)性率達(dá)100%[9]。肉種雞在開(kāi)產(chǎn)前或30周齡左右極其易感，劉東等[10]對(duì)江蘇、遼寧、河南、山東、河北等的101個(gè)雞場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，其中96個(gè)雞場(chǎng)的發(fā)病雞在150日齡～300日齡。陳琳等[11]將純化的B亞型aMPV重組G蛋白作為診斷抗原，建立了檢測(cè)B亞型aMPV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果顯示肉種雞的陽(yáng)性率為最高，商品蛋雞陽(yáng)性率最低。但血清學(xué)方法僅能檢測(cè)出雞群的抗體水平，無(wú)法檢測(cè)雞群帶毒情況；病毒分離方法所需試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且病毒分離較困難；而分子生物學(xué)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)已成為動(dòng)物病原檢測(cè)的重要方法[12-13]。F蛋白是禽偏肺病毒的主要表面抗原蛋白，在免疫選擇壓力下易產(chǎn)生抗原漂變[14]，所以本試驗(yàn)參照GenBank已公布的B亞型禽偏肺病毒F基因相對(duì)保守的片段設(shè)計(jì)引物，建立了RT-PCR方法，并對(duì)我國(guó)部分地區(qū)aMPV展開(kāi)分子流行病學(xué)調(diào)查，旨在分析目前我國(guó)aMPV的流行狀況并建立防控措施。

應(yīng)用RT-PCR方法，對(duì)江蘇、遼寧、河南、山東、河北等地區(qū)的種雞群采取的鼻甲骨和鼻黏液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果雞群中aMPV陽(yáng)性感染率達(dá)50.7%，表明aMPV在我國(guó)部分地區(qū)的商品雞群中普遍感染，肉種雞比蛋雞更易感，產(chǎn)蛋期蛋雞陽(yáng)性率7.5%，肉種雞高達(dá)88%。隨機(jī)挑取9個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果均為B亞型禽偏肺病毒，與國(guó)內(nèi)B型代表株之間的核苷核序列同源性為99.4%～99.9%，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[15]，而與歐洲代表株核苷核序列同源性為97.6%～97.9%。同時(shí)有報(bào)道稱(chēng)在近20多年間分離自歐洲的B亞型aMPV的F蛋白(與其相對(duì)應(yīng)的基因)在B型病毒株之間的同源性大于98%，表明該蛋白的變異幅度非常小[16]， 而本文中的9個(gè)毒株，F(xiàn)基因變異幅度也比較小。

在國(guó)外，對(duì)于該病的發(fā)生除加強(qiáng)管理外，疫苗免疫也是主要防控手段，現(xiàn)已研制出B亞型弱毒苗VCO3株用于保護(hù)火雞或雞免受aMPV的感染[17]，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化aMPV活苗、滅活疫苗、亞單位疫苗基因工程疫苗可用，因此，研究生產(chǎn)針對(duì)國(guó)內(nèi)流行毒株的疫苗迫在眉睫。

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Molecular Epidemiology Analysis of aMPV in Some Regions in China during 2012 to 2015

ZHU Yan-mei,GONG Xiao,GUO Wei-wei,XU Bao-juan,LI Lu-mei,LANG Feng,LIU Hong-xiang,LIU Dong,FAN Gen-cheng

(StateKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineeringVaccine/QingdaoYebioBiologicalEngineeringCo.,Ltd.,Qingdao,Shandong,266114,China)

To investigate the molecular epidemiology of aMPV in China,turbinate and nasal mucus of hen flocks with swollen head symptoms were collected from Jiangsu,Liaoning,Henan,Shandong and Hebei and tested by RT-PCR.9 PCR positive products were randomly selected,and the sequence and genetic evolution of F gene were analyzed.The results indicated that 142 of 280 samples were positive and the positive rate was 50.7%.The F gene homology was 99.4% to 100% among 9 samples,and that the homology of the B type aMPV strains was 97.7% to 99.9%;whereas the homologies of the A type,C type and D type were 71.9% to 79.4%. Moreover, the analysis of phylogenetic tree showed that all 9 tested strains belong to B genotype.In conclusion,there are current aMPV infections in broiler flocks in China,and the B strain is the dominant genotype.This study provided the basis for the development of aMPV vaccine.

Avian metapneumovirus;epidemiology;F gene;homology

2016-03-01

朱艷梅(1985-)，女，河南商丘人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S858.31;S852.659.5

A

1007-5038(2016)10-0030-05