徐淳 李潤(rùn)平

[摘要] 目的 考察間歇吸氧對(duì)小鼠肺、腦組織中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6（Prx 6）含量的影響，探討間歇吸氧對(duì)抗氧中毒的機(jī)制。 方法 將小鼠隨機(jī)分為正常組、持續(xù)暴露后即刻組、間歇暴露后即刻組、持續(xù)暴露后24 h組和間歇暴露后24 h組，通過(guò)不同暴露方法，分別取小鼠肺、腦組織采用免疫組織化學(xué)和Wester blot等方法測(cè)定Prx 6的含量。 結(jié)果 經(jīng)高壓氧暴露的各組小鼠肺組織中Prx 6的含量均明顯高于正常組（P < 0.05或P < 0.01），持續(xù)暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組含量明顯高于持續(xù)暴露后24 h組（P < 0.01），并且高于各自對(duì)應(yīng)的暴露后即刻檢查的結(jié)果（P < 0.01）。經(jīng)高壓氧暴露的各組小鼠腦組織中Prx 6的含量均明顯低于正常組（P < 0.01），持續(xù)暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組與持續(xù)暴露后24 h組高于各自對(duì)應(yīng)的暴露后即刻檢查的結(jié)果（P < 0.05），且間歇暴露后24 h組含量接近正常組（P > 0.05）。 結(jié)論 間歇吸氧可以促進(jìn)肺、腦組織中Prx 6的含量增加，從而增強(qiáng)組織的抗氧化能力。

[關(guān)鍵詞] Peroxiredoxin 6；高壓氧；間歇吸氧；氧中毒

[中圖分類(lèi)號(hào)] R459.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（c）-0018-04

Effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 in the lung and brain of mice

XU Chun1 LI Runping2▲

1.Department of Outpatient， the 61565 Troops of People's Liberation Army， Beijing 102699， China； 2.Department of Diving Medicine， Faculty of Naval Medicine， the Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 （Prx 6） in the lung and brain of mice， and to explore the mechanism underlying intermittent hyperbaric oxygen exposure protecting against oxygen toxicity. Methods Mice were randomly divided into normal group， immediate group after continuous exposure， immediate group after intermittent exposure， live 24 h group after continuous exposure， live 24 h group after intermittent exposure. The content of Prx 6 in the lung and brain were detected using immunohistochemistry and western blot analysis respectively. Results In lung， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were increased （P < 0.05 or P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 content of live 24 h group after intermittent exposure was significantly higher than that of live 24 h group after continuous exposure （P < 0.01）， and the result in each live 24 h group was also higher than that in each immediate group （P < 0.01）. In brain， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were decreased （P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 contents in each live 24 h group was higher than that in each immediate group （P < 0.05）， and the content of live 24 h group after intermittent exposure was close to the normal group （P > 0.05）. Conclusion Intermittent hyperbaric oxygen exposure can facilitate the expression of Prx 6 in lung and brain， and this may be related to the enhanced ability to protect against oxygen toxicity.

[Key words] Peroxiredoxin 6； Hyperbaric oxygen； Intermittent hyperbaric oxygen exposure； Oxygen toxicity

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶家族成員中的抗氧化蛋白（peroxiredoxin，Prxs）在體內(nèi)廣泛分布，現(xiàn)已知在哺乳動(dòng)物中至少存在6種Prx亞型（Prx Ⅰ～Ⅵ）。它們利用包含巰基的蛋白，將過(guò)氧化物還原，起到降解毒性的作用[1-5]。高壓氧暴露時(shí)，體內(nèi)各種產(chǎn)生氧自由基的環(huán)節(jié)被激活，生成大量的活性氧（ROS），這些活性氧一方面可以氧化體內(nèi)各種物質(zhì)而導(dǎo)致組織損傷，另一方面也可以啟動(dòng)和參與細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，具有強(qiáng)大的病理生理學(xué)功能[6-10]。間歇吸氧很可能通過(guò)激活Prxs，進(jìn)而降解活性氧，實(shí)現(xiàn)其對(duì)抗氧中毒發(fā)生的作用。故本研究將探討間歇高壓氧暴露對(duì)小鼠肺、腦組織中抗氧化蛋白（Prx 6）含量的影響，以期為闡明間歇吸氧預(yù)防氧中毒的作用機(jī)制提供部分科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與氣體

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用高壓艙，設(shè)計(jì)工作壓力為2.5 MPa。醫(yī)用純氧，氮氧混合氣購(gòu)于上海市江南氣體公司。

1.2 動(dòng)物及分組

購(gòu)入10月齡雄性C57BL/6小鼠共50只，體重20～22 g，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第14-2-6號(hào)。飼予正常飼料，自由飲水和12 h照明循環(huán)，適應(yīng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5組，包括正常組（未經(jīng)高壓氧暴露）、持續(xù)暴露后即刻組（持續(xù)暴露法結(jié)束即刻取材）、間歇暴露后即刻組（間歇暴露法結(jié)束即刻取材）、持續(xù)暴露后24 h組（持續(xù)暴露法結(jié)束繼續(xù)存活24 h后取材）和間歇暴露后24 h組（間歇暴露法結(jié)束繼續(xù)存活24 h后取材），每組10只并作相應(yīng)標(biāo)記。

1.3 高壓氧暴露方法

①持續(xù)暴露法：將持續(xù)暴露后即刻組和持續(xù)暴露后24 h組小鼠勻速加壓至280 kPa，持續(xù)暴露至6 h后停止高壓氧暴露，將艙內(nèi)壓力勻速減至常壓出艙。②間歇暴露法：將間歇暴露后即刻組和間歇暴露后24 h組小鼠在暴露過(guò)程中，交替呼吸60 min的O2和30 min的氮氧混合氣（氧濃度為20%），至6個(gè)循環(huán)后停止暴露減壓出艙。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Prx 6在肺和腦組織中的表達(dá)

小鼠經(jīng)生理鹽水和多聚甲醛灌注后，取肺和腦組織，常規(guī)石蠟包埋，制片。免疫組化采用SP法，切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3% H2O2孵育，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常兔血清封閉，一抗為兔抗鼠多克隆抗體（購(gòu)自abcam公司），1∶500稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（購(gòu)自Sant Cruz公司），37℃孵育60 min，用DAB顯色，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果掃描輸入電腦后每組隨機(jī)選擇20個(gè)細(xì)胞用圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組灰度值進(jìn)行測(cè)定。

1.5 Western blot分析Prx 6在肺和腦組織中的表達(dá)

采用頸椎脫臼法處死，快速取小鼠肺和腦組織，經(jīng)漂洗吸干水分后置入4℃組織蛋白裂解緩沖液（購(gòu)自凱基生物公司）中勻漿，9500 r/min離心20～30 min，離心半徑12 cm，吸取上清，測(cè)定蛋白濃度，用十二烷基硫酸鈉，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白至PVDF膜（購(gòu)自AMERSCO公司），用含脫脂奶粉的TBST緩沖液包被PVDF膜2 h后，浸入含脫脂奶粉的TBST稀釋兔抗鼠多克隆抗體（購(gòu)自abcam公司）1∶500稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后轉(zhuǎn)入含脫脂奶粉的TBST稀釋的二抗（購(gòu)自Sant Cruz公司）中2 h，TBST充分漂洗后，ECL發(fā)光法（購(gòu)自Pierce Biotechnology公司）檢測(cè)Prx 6蛋白表達(dá)水平。內(nèi)參照用小鼠源單克隆抗體β-actin（購(gòu)自Sigma公司），二抗為羊抗小鼠IgG（購(gòu)自康成生物公司），均為1∶2000稀釋。結(jié)果掃描入電腦后用圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)定各組Prx 6蛋白和β-actin的積分灰度值，用各組Prx 6蛋白積分灰度值除以相應(yīng)的β-actin積分灰度值獲得相對(duì)積分灰度值，做圖時(shí)以正常組為1，其余各組以其與正常組相對(duì)比值計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高壓氧暴露對(duì)小鼠肺組織中Prx 6含量的影響

免疫組化結(jié)果顯示，Prx 6在肺組織中主要分布于肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞以及血管上皮細(xì)胞中。免疫組化結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果均示：經(jīng)高壓氧暴露的各組小鼠肺組織中Prx 6的含量均明顯高于正常組（P < 0.05或P < 0.01），持續(xù)暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組含量明顯高于持續(xù)暴露后24 h組（P < 0.01），并且高于各自對(duì)應(yīng)的暴露后即刻檢查的結(jié)果（P < 0.01）。見(jiàn)圖1～3。

A：正常組；B：持續(xù)暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續(xù)暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖1 小鼠肺組織中Prx 6的免疫組化檢測(cè)結(jié)果（200×）

A：正常組；B：持續(xù)暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續(xù)暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖2 小鼠肺組織中Prx 6的Western blot檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與持續(xù)暴露后24 h組比較，▲▲P < 0.01

圖3 小鼠肺組織中Prx 6的Western blot檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（n = 4）

2.2 高壓氧暴露對(duì)小鼠腦組織中Prx 6含量的影響

免疫組化結(jié)果顯示，Prx 6在腦組織中主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突等膠質(zhì)細(xì)胞中。免疫組化結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示：經(jīng)高壓氧暴露的各組小鼠腦組織中Prx 6的含量均明顯低于正常組（P < 0.01），持續(xù)暴露后即刻組與間歇暴露后即刻組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），間歇暴露后24 h組高于持續(xù)暴露后24 h組（P < 0.05），并且高于各自對(duì)應(yīng)的暴露后即刻檢查的結(jié)果（P < 0.05），且間歇暴露后24 h組含量接近正常組（P > 0.05）。見(jiàn)圖4～6。

A：正常組；B：持續(xù)暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續(xù)暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖4 小鼠腦組織中Prx 6的免疫組化檢測(cè)結(jié)果（100×）

A：正常組；B：持續(xù)暴露后即刻組；C：間歇暴露后即刻組；D：持續(xù)暴露后24 h組；E：間歇暴露后24 h組

圖5 小鼠腦組織中Prx 6的Western blot檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，**P < 0.01；與持續(xù)暴露后24 h組比較，▲P < 0.05

圖6 小鼠腦組織中Prx 6的Western blot檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析（n = 4）

3 討論

大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明，采用間歇性短時(shí)間吸入氧分壓相對(duì)較低的混合氣或壓力相等的壓縮空氣，可以有效延緩長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)吸高壓氧過(guò)程中發(fā)生氧中毒的時(shí)間。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其機(jī)制的研究甚少[11-12]。Frank等[13]發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于96～101 kPa（0.95～1.0 ata）的氧氣中48 h，然后給予24 h的空氣“休息期”，它們可以耐受以后3～7 d的高氧暴露，僅有輕度肺水腫，無(wú)死亡。氧耐力提高的誘導(dǎo)作用與“休息期”后再次暴露于高壓氧時(shí)肺內(nèi)的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的顯著增加相關(guān)。即使將吸空氣的“休息期”時(shí)間縮短到6 h，所有大鼠在再次暴露于高壓氧時(shí)都能存活。Harabin等[14]研究指出間歇暴露組的實(shí)驗(yàn)鼠驚厥潛伏期和生存時(shí)間均明顯高于持續(xù)暴露組。這些都提示間歇暴露可能與提高氧耐力的機(jī)制有關(guān)，在能夠引起相當(dāng)毒性的高壓氧暴露之后，給予適當(dāng)?shù)目諝饣謴?fù)期，能在隨后的高壓氧暴露中誘導(dǎo)抗氧化酶的產(chǎn)生，從而對(duì)抗氧中毒。

研究表明，Prx 6是具有非硒依賴(lài)性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和非鈣離子依賴(lài)性磷脂酶A雙重功能的蛋白[15-19]。它可以利用還原因子谷胱甘肽還原有機(jī)或無(wú)機(jī)的氧化物如過(guò)氧脂質(zhì)和H2O2等。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)時(shí)間高壓氧暴露可刺激機(jī)體肺組織中Prx 6含量明顯升高，并且暴露結(jié)束小鼠繼續(xù)存活24 h后，含量升高得更加明顯，這是機(jī)體對(duì)高壓氧暴露引起的氧化性肺損傷的一種保護(hù)作用。在腦組織中，高壓氧暴露可以導(dǎo)致Prx 6含量明顯降低，筆者分析這可能與Prx 6在肺組織表達(dá)比腦組織高，研究發(fā)現(xiàn)Prx 6在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管的Clara細(xì)胞中存在高度表達(dá)[20-21]，也可能與不同的間歇暴露方案或者暴露模式導(dǎo)致抗氧化酶活性發(fā)生不同改變有關(guān)。但暴露結(jié)束24 h后，Prx 6含量較暴露結(jié)束后即刻顯著升高，同樣表明機(jī)體存在一個(gè)大量產(chǎn)生Prx 6來(lái)對(duì)抗和修復(fù)氧化性損傷的過(guò)程。這些結(jié)果表明Prx 6對(duì)高壓氧導(dǎo)致的氧化損傷反應(yīng)較為敏感，是一個(gè)較為快速產(chǎn)生的抗氧化分子。研究結(jié)果同時(shí)顯示，高壓氧暴露結(jié)束24 h后，間歇暴露組肺、腦組織中Prx 6的含量更高，表明間歇吸氧可以更加有力地促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生Prx 6來(lái)對(duì)抗氧化損傷，這可能與其能夠有效延緩氧中毒發(fā)生有較為密切的聯(lián)系。

與已有的間歇吸氧引起機(jī)體內(nèi)各種與氧化還原有關(guān)的酶活性或含量變化存在升高與降低等不一致情況不同[14]，筆者的初步研究顯示，間歇吸氧可以刺激機(jī)體內(nèi)與氧中毒密切相關(guān)的肺、腦組織中Prx 6的含量顯著升高，這一結(jié)果為從間歇吸氧提高機(jī)體抗氧化能力的角度闡明其作用機(jī)制找出了一個(gè)新的聯(lián)結(jié)點(diǎn)，也為進(jìn)一步尋找能夠有效對(duì)抗氧中毒的措施提供了新的關(guān)注點(diǎn)，這對(duì)于深入闡明間歇吸氧對(duì)抗氧中毒的機(jī)制具有重要意義。

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（收稿日期：2015-11-10 本文編輯：張瑜杰）