張彩凌*， 牛春芳， 葛興信， 武獻(xiàn)春

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065001)

類胡蘿卜素是一種重要的天然色素，它不僅是一種很好的食品添加劑,而且廣泛應(yīng)用于化妝品、保健品等。同時(shí)類胡蘿卜素在人體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，可對(duì)一些疾病起到預(yù)防和治療作用[1]。目前，對(duì)類胡蘿卜素的分析多采用高效液相色譜法(HPLC)。而HPLC法用于類胡蘿卜素分離分析時(shí)最常用C18柱，流動(dòng)相常用甲醇、異丙醇、乙腈、水，并配以一些溶劑如正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，采用梯度洗脫[2 - 6]。但是C18柱對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的類胡蘿卜素及其異構(gòu)體的分離仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)[7]，最為典型的情況是玉米黃質(zhì)和葉黃素兩者互為異構(gòu)體，分離起來比較困難。1992年，Craft[8]首次應(yīng)用C30柱分離類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品和血清中的類胡蘿卜素。隨后人們嘗試用C30柱來優(yōu)化類胡蘿卜素的分離[9]。尤其是在分離葉黃素和玉米黃質(zhì)這兩種結(jié)構(gòu)非常相似的化合物上，C30柱顯示出了明顯的優(yōu)勢(shì)。目前還未見報(bào)道采用C30柱HPLC法分離檢測(cè)柵藻中各種色素含量的報(bào)道。

微藻是生產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳來源，柵藻是一種常見的淡水微藻，含有豐富的類胡蘿卜。本文以該藻為研究對(duì)象，用C30-HPLC法對(duì)其中的蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素5種類胡蘿卜素的含量進(jìn)行測(cè)定，此方法具有分離效果好、多組分同時(shí)分析的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó),Agilent公司)，配紫外檢測(cè)器；3-15高速離心機(jī)(Sigma)，超聲波清洗儀(南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：蝦青素(純度96.0%)、玉米黃質(zhì)(純度85%)、角黃素(純度≥98%)購于Toronto Research Chemicals Inc)；葉黃素(純度≥90%)購于Seebio Biotech,Inc；β-胡蘿卜素標(biāo)品(純度≥93%)購于Sigma，各標(biāo)準(zhǔn)品-18 ℃避光儲(chǔ)存于。稱取適量5種色素的標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷和丙酮的混合液溶解(超聲波促進(jìn)溶解)，加入適量的2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)，定容于25 mL棕色瓶中，充氮?dú)獠⒂?18 ℃冰箱避光保存。二甲基亞砜、丙酮、乙腈、二氯甲烷均為分析純，甲醇和甲基叔丁基醚均為色譜純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 提取與皂化

準(zhǔn)確稱取50 mg藻粉，加入4 mL 二甲基亞砜(DMSO)，放入超聲波清洗儀中于20 ℃超聲15 min，離心，取上清液，剩余藻渣加入4 mL提取液二氯甲烷∶甲醇混合液(體積比 25∶75)，放入超聲波清洗儀中20 ℃超聲15 min，離心，取上清液；重復(fù)此步驟直至上清液和藻渣變白。合并上清液，加入1/6體積的0.107 mol/L NaOH-甲醇溶液，混勻，充氮?dú)?，? ℃冰箱中黑暗冷皂化12 h。于上述皂化液中加入3～5 mL石油醚，震蕩均勻后加入與皂化液等體積的蒸餾水，靜置分層后，吸取上層液體；剩余液體繼續(xù)加入石油醚提取，直至色素全部抽提完全。合并上層液體，氮?dú)獯蹈?，然后? mL提取液定容，經(jīng)0.22 μm針筒式有機(jī)濾膜過濾，濾液待測(cè)。

1.3 高效液相色譜法測(cè)定條件

色譜柱：YMC-carotenoid C30柱(250×4.6 mm,5 μm，日本YMC公司)；流動(dòng)相：A為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(體積比81∶15∶4)，流動(dòng)相B為甲醇∶甲基叔丁基醚∶水混合液(體積比 7∶90∶3)。洗脫程序：0～55.6 min,100%～44.4%A；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：20 ℃。外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定性

由于類胡蘿卜素是由多個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成，其中所含的多個(gè)雙鍵導(dǎo)致該類化合物具有極大的不穩(wěn)定性，在光照下易被破壞，很容易被空氣中的氧或過氧化物氧化，所以混標(biāo)應(yīng)該避光低溫保存。樣品前處理過程中應(yīng)盡快完成且盡量避免強(qiáng)光，控制操作溫度，利用超聲波提取時(shí)需控制提取溫度在20 ℃以下，皂化在低溫條件下進(jìn)行并且不能時(shí)間太長(zhǎng)，充氮?dú)狻?/p>

2.2 提取及皂化方法的考察

天然蝦青素是以酯的形式存在,一般采用提取皂化的方法進(jìn)行測(cè)定。孫偉紅[10]等人采用二氯甲烷、甲醇提取經(jīng)堿皂化的微藻中的色素，但因5種色素溶解度的差異性，所以不適合采用2種溶劑提取。本實(shí)驗(yàn)采用DMSO超聲破壁的方法預(yù)提取柵藻中的色素，再采用混合溶劑提取，使柵藻中的5種色素達(dá)到充分的溶出提取。而對(duì)于β-胡蘿卜素則同時(shí)采用了直接提取測(cè)定和提取皂化測(cè)定的方法，并且對(duì)于兩種方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明皂化不會(huì)影響β-胡蘿卜素含量測(cè)定，所以最終對(duì)樣品采用提取皂化的方法處理。對(duì)于樣品中的角黃素進(jìn)行了提取率實(shí)驗(yàn)，測(cè)得提取率為91%。

2.3 色譜分離與定性

選擇C30柱,柱溫20 ℃，比較了乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚體系做流動(dòng)相、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚/磷酸體系做流動(dòng)相、甲醇∶水∶甲基叔丁基醚體系做流動(dòng)相進(jìn)行分離分析，發(fā)現(xiàn)乙腈∶甲醇∶甲基叔丁基醚體系、乙腈∶水∶甲基叔丁基醚∶磷酸體系做流動(dòng)相玉米黃質(zhì)與葉黃素?zé)o法很好分離，因此本實(shí)驗(yàn)選取甲醇∶水∶甲基叔丁基醚體系做流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。借鑒Sander[11]等應(yīng)用的C30柱分離類胡蘿卜素的方法，對(duì)洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，縮短了樣品分析的時(shí)間。圖1(A)為蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素混合標(biāo)樣的液相色譜圖，圖1(B)為柵藻樣品皂化提取液的色譜圖。從圖中可見，在本實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下，5種色素得到較好的分離。對(duì)5種色素的分離進(jìn)行了分離度和理論塔板數(shù)的計(jì)算，結(jié)果表明5種色素的分離度都在2.0以上，理論塔板數(shù)都在6 000以上，能夠滿足測(cè)定要求。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

配制5種色素的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；以3倍信噪比(S/N)測(cè)得各組分的檢出限。蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和β-胡蘿卜素在一定濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表1。

表1 方法的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 回收率與精密度試驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的可靠性，進(jìn)行了回收率和精密度(RSD)試驗(yàn)。每一加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果如表2所示。由表2可見，添加回收率高，準(zhǔn)確度和精密度都能滿足類胡蘿卜素含量測(cè)定要求，適用于柵藻中類胡蘿卜的含量測(cè)定。

表2 方法的加標(biāo)回收率(n=5)

3 結(jié)論

本文建立了柵藻中5種類胡蘿卜素提取皂化的方法,使得一次性同時(shí)分離檢測(cè)5種色素的含量成為可能，該處理方法節(jié)省時(shí)間，準(zhǔn)確可靠。C30-高效液相色譜-紫外檢測(cè)法檢測(cè)5種類胡蘿卜素，分離度、理論塔板數(shù)均可以滿足分離分析要求。該方法準(zhǔn)確、可靠，操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)定性定量分析柵藻中5種類胡蘿卜素的含量。