榮維廣， 宋寧慧， 彭凡立， 王春蕾， 朱 峰，阮麗萍， 劉華良， 吉文亮*

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心,江蘇南京 210009；2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇南京 210042；3.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇南京210009)

食醋是一種常見的調(diào)味品，它不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分且具有獨(dú)特的藥理作用。食醋在生產(chǎn)加工中大部分需要加入焦糖色素，而在生產(chǎn)過程中加入氨(銨)催化劑的焦糖色素的形成過程中容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)過程中能夠產(chǎn)生許多對(duì)人體有害的化學(xué)物質(zhì)[2]，如4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)和2-乙酰基-4-(1,2,3,4-四羥基丁基)咪唑(2-Acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl) imidazole，THI)。4-MEI為神經(jīng)毒素[3]，具有強(qiáng)烈的致驚闕作用，并且美國(guó)國(guó)家毒品管理計(jì)劃和其它研究者已經(jīng)有明確的毒理學(xué)數(shù)據(jù)證明其具有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[4 - 8]。2011年，國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)(IARC)將甲基咪唑類化合物認(rèn)定為2B類致癌物[9]，而THI可引起免疫毒性[10 - 12]。因此，建立食醋中4-MEI和THI的檢測(cè)方法對(duì)保證食醋的品質(zhì)及食用安全尤為重要。

目前，針對(duì)食醋中2-MEI和THI的測(cè)定尚無文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)可查，而可供參考的僅有食品添加劑焦糖色衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 8817-2001)[13],標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了焦糖色素中4-MEI含量的測(cè)定方法，采用薄層法測(cè)定，而對(duì)于THI的測(cè)定尚無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。近年來，眾多分析工作者建立的4-MEI和THI在焦糖色素中的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[13]、氣相色譜法[14 - 16]、液相色譜法[17,18]、離子色譜法[18]、毛細(xì)管電泳法[19]、氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[20]和液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[21,22]，但這些方法普遍需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，分析時(shí)間冗長(zhǎng)。

高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS) 集合了液相色譜的分離能力和串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的高靈敏度定量監(jiān)測(cè)能力，已成為定量分析強(qiáng)有力的工具，非常適合快速檢測(cè)。采用直接進(jìn)樣方式檢測(cè)食醋中4-MEI和THI，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單稀釋、調(diào)節(jié)pH值，過濾膜后HPLC-MS/MS直接進(jìn)樣測(cè)定。此方法簡(jiǎn)單快速，且不使用有機(jī)溶劑，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的欠缺。本研究建立了采用超純水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋、調(diào)節(jié)pH值，HPLC-MS/MS 直接進(jìn)樣測(cè)定食醋中4-MEI和THI的方法。該方法靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確，適合大批量食醋中4-MEI和THI的檢測(cè)及確證分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Accela高效液相色譜儀，TSQ Quantum Access Max串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)(美國(guó)，Thermo Fisher公司)；渦旋快速混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；純水儀(美國(guó)，Millipore)。

4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自西格瑪公司，純度均≥99.0%；d6-4-甲基咪唑(d6-4-methylimidazole，d6-4-MEI)購(gòu)自加拿大C/D/N公司，純度≥99.0%。甲醇、乙腈為色譜純(Merck)；氨水為優(yōu)級(jí)純(含量25%～28%，南京化學(xué)試劑有限公司)；水系微孔濾膜(0.22 μm，南京榮華科學(xué)器材有限公司)；超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別稱取4-MEI、THI和d6-4-MEI標(biāo)準(zhǔn)品0.0125 g(精確至0.1 mg)，用超純水分別溶解定容至 25 mL，分別配制成0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)使用需要用水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的中間溶液和標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。均置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1白醋和米醋吸取樣品1 mL，加超純水稀釋定容至20 mL，渦旋混勻后經(jīng)1 mol/L氨水溶液調(diào)節(jié)pH=9左右，靜置5 min，采用0.22 μm水系微孔濾膜過濾，濾液收集到1.5 mL進(jìn)樣小瓶中，待檢測(cè)。

1.3.2香醋和陳醋吸取樣品1 mL，加超純水稀釋定容至50 mL，其它操作同1.3.1。

1.4 液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1液相色譜條件色譜柱：Polaris C18-A柱 (150×4.6 mm,3 μm)；流動(dòng)相： A 為乙腈，B 為0.05%氨水溶液；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～5 min，5%A；5～10 min，5% ～40%A；10～10.1 min，5%A；10.1～12 min，5%A。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2串聯(lián)質(zhì)譜條件電離方式：ESI+；離子噴霧電壓：正離子4 000 V；揮發(fā)氣溫度：400 ℃；毛細(xì)管溫度：270 ℃；鞘氣：60 Arb；輔助氣：15 Arb；碰撞氣：氬氣；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring，MRM)。參數(shù)詳見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 流速的優(yōu)化

流速不僅會(huì)影響出峰時(shí)間、色譜峰的峰形，同時(shí)也會(huì)影響目標(biāo)物與基質(zhì)的分離情況。實(shí)驗(yàn)比較了0.3 mL/min、0.4 mL/min和0.5 mL/min流速情況下對(duì)峰形及分離的影響，結(jié)果在0.4 mL/min條件下峰形較好，并且待測(cè)物THI與基質(zhì)分離較好，定量更準(zhǔn)確。

2.2 進(jìn)樣溶液pH值和取樣量的優(yōu)化

目標(biāo)化合物在深色醋和淺色醋中屬于痕量物質(zhì)，若采用傳統(tǒng)萃取方法，重現(xiàn)性差，成本高，且會(huì)使用大量有機(jī)溶劑。本研究采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)行分析，但為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定的影響，還需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理。選取若干主流品牌的深色的香醋和陳醋分別稀釋 10～100 倍進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在較低稀釋倍數(shù)下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)干擾逐漸減小，響應(yīng)值增加，當(dāng)稀釋倍數(shù)為 20～50倍時(shí)，信噪比達(dá)到最佳，繼續(xù)增大稀釋倍數(shù)，響應(yīng)值降低。本文最終選擇深色的香醋和陳醋的稀釋倍數(shù)為 50 倍。同樣方法確定淺色的白醋和米醋最佳稀釋倍數(shù)為 20 倍。

本研究采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)行分析，由于樣品醋的pH值較低，進(jìn)樣溶液pH值將影響目標(biāo)化合物4-MEI 和THI的峰形和保留時(shí)間，因此有必要對(duì)進(jìn)樣溶液調(diào)節(jié)pH值。分別將進(jìn)樣溶液用氨水將pH值調(diào)節(jié)到7.0、8.0和9.0，靜置5 min后過0.22 μm水系微孔濾膜進(jìn)樣，當(dāng)pH為9.0時(shí)，無論是峰形、保留時(shí)間和峰面積均能穩(wěn)定的重現(xiàn)。經(jīng)驗(yàn)證，將pH調(diào)到9.0對(duì)于深色的香醋、陳醋和淺色的白醋、米醋同樣適用。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L，在選定的條件下測(cè)定，得到4-MEI和THI的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。在0.01～1.0 mg/L 線性范圍內(nèi)，4-MEI和THI均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程分別為：Y=0.0601+0.0213X和Y=-0.0967+0.0164X，相關(guān)系數(shù)均大于0.9991。圖1為4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖，圖2為典型陳醋樣品中4-MEI和THI添加回收多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

本研究根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)得到4-MEI和THI的最低檢出濃度為0.003 mg/L。當(dāng)淺色的白醋和米醋取樣為1 mL，經(jīng)本研究確定的前處理方法處理后最終定容到20 mL檢測(cè)分析，得到4-MEI和THI的檢出限(LOD)均為0.06 mg/L，根據(jù)10 倍信噪比(S/N=10)得到定量限(LOQ)均為0.2 mg/L。深色的香醋和陳醋取樣為1 mL，經(jīng)本研究確定的前處理方法處理后最終定容到50 mL檢測(cè)分析，得到4-MEI 和THI的LOD均為0.15 mg/L，LOQ均為0.5 mg/L。

2.3.2方法的準(zhǔn)確度和精密度本方法分別選取深色和淺色的醋的代表性樣品，設(shè)置0.2 mg/L、0.5 mg/L和2.0 mg/L三個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。4-MEI的平均回收率為91.5%～101.4%，THI的平均回收率為80.2%～87.2%，準(zhǔn)確度均較好，RSD均小于6.4%，見表2。

表2 加標(biāo)樣品的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

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2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買的18份食醋樣品進(jìn)行了檢測(cè)(白醋、米醋、香醋和陳醋的份數(shù)分別為3、3、6和6份)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見表3。全部樣品均未檢出THI；所有白醋和米醋均未檢出4-MEI；部分香醋和陳醋4-MEI有檢出。

表3 樣品醋中4-MEI和THI含量(n=3)

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3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜直接測(cè)定食醋中 4-MEI和THI 含量的快速測(cè)定和確證方法。應(yīng)用本方法可在 20 min 內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)分析過程，分析效率很高。樣品經(jīng)超純水稀釋后調(diào)節(jié)pH值后直接進(jìn)樣測(cè)定，在選定的色譜，質(zhì)譜條件下，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物測(cè)定基本無干擾，避免了傳統(tǒng)方法中復(fù)雜的萃取、凈化等前處理過程。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能夠滿足食醋中4-MEI和THI 的分析要求，適合大批量食醋樣品中 4-MEI和THI 的定性和定量分析。