白新偉*, 王毅紅， 陳定梅， 田 玲

(六盤水師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，貴州六盤水 553004)

竹蓀(Dictyophoraindusiata)別名“竹笙”，隸屬真菌門，是主要分布在我國(guó)貴州、云南等高山地區(qū)寄生在枯竹根部的名貴食藥兩用菌[1]，含有豐富的氨基酸[2]、多糖[3]、維生素，有 “真菌之花”、“菌中皇后”的美譽(yù)。竹蓀子實(shí)體由菌蓋、菌裙、菌柄、菌托組成，由于菌托和菌蓋口感較差，在采收或加工商品竹蓀過(guò)程中被丟棄[4]，而菌托約占竹蓀鮮重的55%，菌蓋為鮮重的11%，即每生產(chǎn)出1 000 g的鮮商品竹蓀，就有1 680 g的菌托和331 g的菌蓋被丟棄，造成該珍貴食用菌資源的巨大浪費(fèi)。

竹蓀多糖為具有生物活性的大分子物質(zhì)，在抗炎癥[5]、抗腫瘤[6]、刺激免疫[7]、抗氧化[8]等方面都有顯著療效。以往對(duì)竹蓀多糖的研究主要采用氣相色譜[9]、液相色譜[10]和DNS比色法[11]對(duì)竹蓀子實(shí)體整體處理分析，或?qū)⒀芯烤窒拊诳墒车闹裆p菌柄和菌裙部分，缺少對(duì)竹蓀不同部位多糖差異的對(duì)比分析，特別是缺乏對(duì)竹蓀加工中廢棄的菌托和菌蓋研究數(shù)據(jù)，不利于合理利用竹蓀資源。毛細(xì)管電泳作為一種快速、高效的新型分離分析技術(shù)[12]，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域顯示了廣泛的應(yīng)用前景。目前毛細(xì)管電泳法對(duì)植物細(xì)胞多糖的研究主要集中在茯苓[13]、防風(fēng)[14]、藏紅花[15]等中藥材上，對(duì)竹蓀的研究較少。

本研究采用1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮對(duì)糖類物質(zhì)進(jìn)行柱前衍生，克服了傳統(tǒng)的還原氨化衍生法[16]存在的諸如反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不穩(wěn)定基團(tuán)易引起測(cè)定偏差等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)與Honda等[17]采用的單糖衍生試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮相比,采用的衍生試劑衍生化條件更為溫和，產(chǎn)物更穩(wěn)定，靈敏度更高。同時(shí)本研究采用膠束毛細(xì)管電泳分離模式分別對(duì)竹蓀菌子實(shí)體四個(gè)部位多糖水解液的單糖進(jìn)行了定性定量對(duì)比分析，9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了樣品的快速高效基線分離分析。據(jù)此提出竹蓀加工廢棄物菌蓋、菌托綜合利用的可能性，以期為該資源的綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)，Agilent公司)；彈性石英毛細(xì)管：58.5 cm×50 μm i.d.(河北永年光纖公司)。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)，1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，十六烷基硫酸鈉(SDS),十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮0.080 g，定容至10 mL，濃度為5.0×10-2mol/L。準(zhǔn)確稱取葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成單糖濃度均為1.0×10-2mol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2竹蓀樣品處理將竹蓀樣品按照菌蓋、菌裙、菌柄、菌托四個(gè)部位分類切割，并分別提取各部位多糖。多糖提取沿用香菇多糖的提取工藝，主要步驟為：干燥，研細(xì)熱水抽提，過(guò)濾，濃縮，Seveg法脫蛋白，乙醇沉淀，丙酮及無(wú)水乙醇分級(jí)洗滌竹蓀多糖制品。取上述竹蓀多糖5 mg，加2 mol/L的三氟乙酸1 mL，封口后于100 ℃下水解9 h，菌蓋、菌裙、菌柄、菌托多糖水解液分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)，冷卻后用氮?dú)獯抵两?，用水溶解定容? mL，備用。

1.2.3衍生依次向安培瓶中加入100 μL 5.0×10-2mol/L衍生試劑PMP和10 μL多糖水解液，10 μL氨水，密封，于溫度80 ℃水浴中反應(yīng)40 min，取出用氮?dú)獯抵两?，? mL乙腈溶解后，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液的選擇考察了鄰苯二甲酸鹽、乙酸-乙酸鹽、磷酸鹽和硼酸鹽緩沖體系，發(fā)現(xiàn)糖類衍生物在硼酸鹽緩沖體系中分離效果最好。固定其他條件不變，考察了硼酸鹽在15～30 mmol/L時(shí)糖類衍生物的分離效果，發(fā)現(xiàn)硼酸鹽濃度為25 mmol/L時(shí)，遷移時(shí)間較短，分離效率較高。選用能獲得最佳分離效果且時(shí)間相對(duì)較短的硼酸鹽溶液濃度為25 mmol/L；調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值為9.0～9.6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH為9.4時(shí)，分離效果最佳。進(jìn)一步提高pH值，分離效率效果不明顯且極線漂移嚴(yán)重不利于分析測(cè)定。綜合考慮，選擇緩沖溶液pH為9.4。

2.1.2表面活性劑的影響選擇適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┛梢云鸬礁纳齐姖B流[18]，提高分離效果的作用。實(shí)驗(yàn)比較了CTAB、SDS兩種表面活性劑對(duì)分離的影響，加入表面活性劑CTAB對(duì)分離沒(méi)有明顯作用，加入表面活性劑SDS，出峰時(shí)間明顯提前，峰形改善明顯，但是高濃度的SDS導(dǎo)致基線噪音增加。實(shí)驗(yàn)選擇SDS濃度為20 mmol/L。

2.1.3分離電壓的影響實(shí)驗(yàn)比較了電壓在12～16 kV時(shí)對(duì)分離的影響。結(jié)果表明隨著分離電壓的增大，遷移時(shí)間明顯縮短，分離度有所增加；但分離電壓過(guò)高，電流增大，產(chǎn)生較大的焦耳熱，盡管縮短了分析時(shí)間，但組分間的分離度相應(yīng)變差。綜合整體的分離情況，本文選擇的分離電壓為15 kV。

2.1.4溫度對(duì)分離的影響維持恒定的毛細(xì)管溫度對(duì)于逸散毛細(xì)管電泳分離過(guò)程中產(chǎn)生的焦耳熱、改善分離都有一定的作用。在溫度為25～30 ℃范圍內(nèi)，比較了不同溫度下單糖的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度的變化對(duì)分離度的影響不大。為防止溫度過(guò)高產(chǎn)生較大的焦耳熱影響分離效果，選擇分離溫度為25 ℃。

2.2 方法驗(yàn)證

配制系列濃度的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行衍生化及電泳分析，并以單糖的濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：在5～100 μmol/L線性范圍內(nèi)，峰面積和每種分析物濃度之間有很好的相關(guān)性。在信噪比為3的基礎(chǔ)上，5種分析物的檢出限為0.81～1.60 μmol/L。各單糖的分析特性見(jiàn)表1。

表1 單糖的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

在最優(yōu)化條件下，對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液的遷移時(shí)間和峰面積重現(xiàn)性進(jìn)行考察，結(jié)果表明各單糖峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)均小于2.6%，遷移時(shí)間RSD均小于1.8%，表明方法的重現(xiàn)性較好。

為驗(yàn)證該方法的精確性，用標(biāo)準(zhǔn)加入法向竹蓀實(shí)際樣品加標(biāo)，按1.2方法衍生化，在最優(yōu)化條件下做回收率實(shí)驗(yàn)，平行三次實(shí)驗(yàn)，各單糖回收率在94.3%～103.4%之間，結(jié)果顯示該方法對(duì)于上述分析物的同時(shí)測(cè)定是比較準(zhǔn)確的。

2.3 方法應(yīng)用

按前述優(yōu)化條件，對(duì)單糖衍生物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行膠束毛細(xì)管電泳分離，結(jié)果見(jiàn)圖1。竹蓀多糖水解液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ按1.2方法衍生化，典型電泳譜圖見(jiàn)圖2(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將實(shí)際樣品各檢出峰遷移時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品電泳圖譜進(jìn)行對(duì)比定性：竹蓀菌蓋、菌柄多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成。由表2可知：在商品竹蓀加工過(guò)程中丟棄的菌蓋的多糖中葡萄糖含量分別是商品竹蓀的可食菌體部位(菌裙和菌柄)的3.7和1.1倍，甘露糖是其2.5和1.3倍，半乳糖是其3.5和2.2倍；而丟棄的菌托的多糖中單糖含量更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了菌裙和菌柄(除菌托中半乳糖與菌柄中含量相當(dāng)外)，具體含量差距為：葡萄糖含量是菌裙和菌柄的4.3和1.3倍，甘露糖是其4.9和2.6倍，半乳糖是其1.5和0.95倍。據(jù)此可對(duì)菌托、菌蓋進(jìn)行綜合利用。

CarbohydratesContent(mmol/g) PileusAnnulusStipeVolvaGlc0.710.190.650.82Ara00.0900.12Man0.350.140.270.69Fuc0000Gal0.730.210.340.32

3 結(jié)論

膠束毛細(xì)管電泳法對(duì)糖類物質(zhì)分離檢測(cè)的方法，具有線性范圍寬、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用作竹蓀中多糖組成測(cè)定的常規(guī)方法。同時(shí)，通過(guò)對(duì)竹蓀菌子實(shí)體四個(gè)部位多糖水解液對(duì)比分析可知，作為竹蓀加工廢棄物的菌蓋多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，菌托多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，兩種廢棄物多糖含量均超過(guò)竹蓀菌可食的菌裙和菌柄部分。