王雪晴，邢向英，董慶霖，燕 然，李文娜

(1.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130； 2.河北工業(yè)大學(xué) 代謝工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300130)

微藻生長(zhǎng)速率快[1]，易于培養(yǎng)，脂類含量高[2]，是生產(chǎn)生物柴油的主要原料[3-5]。然而，與化石燃料相比，生物柴油的生產(chǎn)成本仍然較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的商業(yè)化生產(chǎn)[6-8]。因此，如何提高微藻產(chǎn)量和脂類含量是生物柴油原料生產(chǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基

柵藻(Scenedesmusobliquus)培養(yǎng)液(含雜菌)購(gòu)自中科院武漢水生生物研究所。

1.5N-BBM培養(yǎng)基：NaNO3375 mg/L，KH2PO4175 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，K2HPO475 mg/L，EDTANa250 mg/L，KOH 31 mg/L，NaCl 25 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，H3BO311.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2·4H2O 1.44 mg/L，Na2MoO41.79 mg/L，CuSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.49 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H2SO41 mL/L。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GXZ-300D光照培養(yǎng)箱，HZQ-QG全溫振蕩器，723N可見(jiàn)分光光度計(jì)，LRH-150S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，XSZ-H光學(xué)顯微鏡，LG16-B臺(tái)式高速離心機(jī)，JY96-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，YX280加壓滅菌鍋，DH-101-0S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌柵藻的制備

在100 mL柵藻培養(yǎng)液中加入15 μL硫酸卡霉素(90 μg/mL)與80 μL硫酸慶大霉素(90 μg/mL)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))。離心收集藻細(xì)胞(8 500 r/min，10 min)，將藻細(xì)胞用無(wú)菌水稀釋至10-4，涂布在添加2%葡萄糖的BBM固體培養(yǎng)基(NaNO3質(zhì)量濃度250 mg/L)，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))。將生長(zhǎng)出的單藻落轉(zhuǎn)接至BBM液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)制備成種子培養(yǎng)液。

1.2.2 柵藻共生微生物的分離與種類確定

柵藻的共生微生物通過(guò)稀釋涂布法分離。取0.5 mL柵藻培養(yǎng)液稀釋至10-3、10-4、10-5，分別涂布在添加2%葡萄糖的BBM固體培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))，根據(jù)菌落不同的形態(tài)特征挑選單菌落，分別轉(zhuǎn)接至LB或PDA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。將分離得到的微生物進(jìn)行顯微鏡觀察與革蘭氏染色，確定微生物種類。

1.2.3 促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)微生物的篩選

在裝有100 mL 1.5N-BBM培養(yǎng)基的錐形瓶中分別接入10 mL無(wú)菌柵藻(1.15×107個(gè)/mL)和1接種環(huán)1.2.2分離的菌體，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))，測(cè)定生物量和脂類含量。

1.2.4 藻-菌混合培養(yǎng)(M)

細(xì)菌接種液的制備：將篩選的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)基內(nèi)，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d(溫度25℃，搖床速度120 r/min)，細(xì)菌發(fā)酵液細(xì)胞濃度約為2×108個(gè)/mL。取4 mL細(xì)菌發(fā)酵液于8 500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，用無(wú)菌水洗滌2次，稀釋，制備細(xì)菌接種液(1×108個(gè)/mL)。

混合培養(yǎng)：在100 mL 1.5N-BBM培養(yǎng)基內(nèi)加入10 mL無(wú)菌柵藻(2.5×107個(gè)/mL)及不同體積細(xì)菌接種液，使接種比例(藻菌細(xì)胞濃度比)達(dá)到1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))，測(cè)定生物量和脂類含量。

1.2.5 添加NaHCO3培養(yǎng)柵藻(C)

在100 mL 1.5N-BBM培養(yǎng)基中加入10 mL無(wú)菌柵藻(2.5×107個(gè)/mL)與不同體積NaHCO3溶液(10 g/L，無(wú)菌過(guò)濾)，使培養(yǎng)液中NaHCO3質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))，測(cè)定生物量和脂類含量。

1.2.6 添加NaHCO3的藻-菌混合培養(yǎng)(MC)

按1.2.4、1.2.5確定的藻菌最佳接種比例和NaHCO3質(zhì)量濃度進(jìn)行添加NaHCO3的藻-菌混合培養(yǎng)(MC)，以柵藻單獨(dú)培養(yǎng)(CK)、藻-菌混合培養(yǎng)(M)、添加NaHCO3培養(yǎng)(C)3種培養(yǎng)方式為對(duì)照，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 d(溫度25℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s))，測(cè)定不同培養(yǎng)方式下的生物量和脂類含量。

1.2.7 反應(yīng)參數(shù)測(cè)定

1.2.7.1 生物量及細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

柵藻生物量(細(xì)胞干重，DCW)參照Dong等[13]的方法測(cè)定。

細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)參照文獻(xiàn)[26-27]按下式計(jì)算。

(1)

(2)

式中：Xn與X0分別為時(shí)間tn與t0時(shí)的生物量。

1.2.7.2 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮濃度

硝態(tài)氮濃度按Hecht等[28]的方法分析測(cè)定。

1.2.7.3 培養(yǎng)液pH

取5 mL柵藻培養(yǎng)液，離心，取上清液用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.7.4 脂類含量、合成動(dòng)力學(xué)參數(shù)及脂肪酸組成

脂類含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[26]方法按下式計(jì)算。

(3)

式中：GL為總脂量；V為藻液體積，X為細(xì)胞濃度(生物量)。

脂類合成動(dòng)力學(xué)參數(shù)參照文獻(xiàn)[26-27]按下式計(jì)算。

(4)

(5)

式中：X0、Xn與G0、Gn分別為t0與tn時(shí)的生物量與脂類含量；r為脂類合成速率。

脂類脂肪酸組成參照文獻(xiàn)[26]方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)菌柵藻

按照1.2.1方法制備無(wú)菌柵藻，發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗生素處理后稀釋的柵藻在平板上形成了無(wú)菌的單藻落(見(jiàn)圖1)。用接種環(huán)將單藻轉(zhuǎn)接至BBM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得無(wú)菌柵藻種子培養(yǎng)液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 柵藻在平板上形成的藻落

2.2 柵藻的共生微生物

按照1.2.2分離柵藻的共生微生物，得到4種微生物，其在平板上形成的菌落見(jiàn)圖2。

注：A.黃色菌(B1)；B.紅色菌(B2)；C.白色菌(B3)；D.白色菌(F1)。

由圖2可看出，分離得到的4種微生物中A、B和C平板菌落為球形，表面及邊緣光滑，呈現(xiàn)黃色、紅色和白色。顯微鏡觀察和革蘭氏染色結(jié)果表明：B1、B2和B3細(xì)胞呈球狀，直徑1.0～3.0 μm，革蘭氏染色分別為陰性、陽(yáng)性和陰性，故B1、B2、B3屬于細(xì)菌。D平板的菌落為疏松的毛絨狀，營(yíng)養(yǎng)菌絲為白色毛絨狀，直徑為1.5～3.5 μm，孢子囊自孢子梗生出，因此F1屬于真菌。將分離的4種微生物分別制備斜面菌種保存。

2.3 促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)的微生物

按1.2.3方法將得到的4種微生物接種至無(wú)菌柵藻中培養(yǎng)，測(cè)定柵藻與不同微生物混合培養(yǎng)的生物量和脂類含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：CK.柵藻單獨(dú)培養(yǎng)；M1.柵藻與B1混合培養(yǎng)；M2.柵藻與B2混合培養(yǎng)；M3.柵藻與B3混合培養(yǎng)；M4.柵藻與F1混合培養(yǎng)。

由圖3可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)M1、M4和M2的生物量與脂類含量均高于CK(0.64 g/L，158.4 mg/g)，生物量分別達(dá)到1.1、1.0、0.92 g/L，脂類含量分別為215.6、211.2、203.4 mg/g，而M3的生物量與脂類含量(0.61 g/L，153.6 mg/g)則低于CK，說(shuō)明細(xì)菌B3對(duì)柵藻的生長(zhǎng)有抑制作用，而細(xì)菌B1、真菌F1和細(xì)菌B2則能促進(jìn)柵藻的生長(zhǎng)。其中細(xì)菌B1對(duì)柵藻生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最顯著，因此將細(xì)菌B1作為促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)的最佳微生物用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

2.4 柵藻與細(xì)菌B1混合培養(yǎng)的最佳接種比例

按照1.2.4方法考察柵藻與細(xì)菌B1不同接種比例混合培養(yǎng)的生物量和脂類含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 柵藻與細(xì)菌B1不同接種比例混合培養(yǎng)的生物量和脂類含量

由圖4可知：柵藻與細(xì)菌B1接種比例為4∶1時(shí)，柵藻生物量與脂類含量分別達(dá)到最高值(1.18 g/L、217.1 mg/g)，較柵藻單獨(dú)培養(yǎng)(CK)的生物量(0.7 g/L)與脂類含量(158.3 mg/g)分別提高了68.6%、37.1%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以柵藻與細(xì)菌B1的最佳接種比例4∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5 促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)的最佳NaHCO3質(zhì)量濃度

按照1.2.5方法考察柵藻在不同NaHCO3質(zhì)量濃度條件下的生物量和脂類含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 柵藻在不同NaHCO3質(zhì)量濃度條件下的生物量和脂類含量

由圖5可知，與柵藻單獨(dú)培養(yǎng)(0.72 g/L，156.8 mg/g)相比，NaHCO3質(zhì)量濃度為0.3 g/L時(shí)柵藻的生物量與脂類含量均達(dá)到最大值(1.38 g/L，225.1 mg/g)，分別提高91.7%和43.6%，因此添加 NaHCO3培養(yǎng)柵藻的最佳NaHCO3質(zhì)量濃度為0.3 g/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中NaHCO3的添加量按此質(zhì)量濃度進(jìn)行。

2.6 不同培養(yǎng)方式下反應(yīng)參數(shù)的比較

2.6.1 生物量及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(見(jiàn)圖6、表1)

表1 不同培養(yǎng)方式下的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：CK.柵藻單獨(dú)培養(yǎng)；M.柵藻與B1以接種比例4∶1混合培養(yǎng)；C.添加0.3 g/L NaHCO3培養(yǎng)柵藻；MC.0.3 g/L NaHCO3條件下，柵藻與B1以接種比例4∶1混合培養(yǎng)。下同。

由圖6可知：CK的生物量初期增長(zhǎng)較為緩慢，8 d后上升速度加快，14 d后趨于穩(wěn)定，最終達(dá)到0.82 g/L；M和C的生物量分別從6 d和4 d開(kāi)始快速上升，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)分別達(dá)到1.38 g/L和1.63 g/L；MC的生物量則在3 d即開(kāi)始迅速上升，至12 d時(shí)趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到2.42 g/L。與CK相比，M、C和MC的生物量分別提高了68.3%、98.8%和195.1%。

由表1可知，與柵藻單獨(dú)培養(yǎng)相比，M、C和MC平均比生長(zhǎng)速率分別提高了20.0%、26.7%和46.7%，平均生長(zhǎng)速率分別提高73.1%、107.7%和211.9%。其中，M促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)的機(jī)理可能與其他光合自養(yǎng)條件下藻-菌混合培養(yǎng)[29-32]的機(jī)理相似，即柵藻光合作用釋放的氧氣和胞外有機(jī)物被細(xì)菌吸收代謝后，解除了高濃度氧對(duì)柵藻光合作用的抑制并釋放出CO2促進(jìn)了光合作用。而C促進(jìn)柵藻生長(zhǎng)的原因顯然是提高了反應(yīng)體系內(nèi)CO2的濃度，進(jìn)而提高了光合作用效率。MC比M和C更能促進(jìn)柵藻的細(xì)胞生長(zhǎng)是由于提高了柵藻對(duì)NaHCO3的吸收。

2.6.2 培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(見(jiàn)圖7)

圖7 不同培養(yǎng)方式下培養(yǎng)液中硝態(tài)氮質(zhì)量濃度變化曲線

由圖7可知，不同柵藻培養(yǎng)液的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在0～2 d均快速下降，這可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的錐形瓶瓶壁吸附或硝態(tài)氮快速進(jìn)入細(xì)胞但未被利用有關(guān)。2～4 d硝態(tài)氮質(zhì)量濃度下降緩慢，4 d開(kāi)始快速下降，其中MC的下降速率最快，至12 d降為0，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)M和C的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為11.8 mg/L和0.1 mg/L，CK中硝態(tài)氮的下降速率最慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的質(zhì)量濃度仍然較高，達(dá)到33.2 mg/L。MC的硝態(tài)氮質(zhì)量濃度下降速率比M和C以及CK的快，說(shuō)明MC較M和C促進(jìn)了柵藻對(duì)NaNO3的吸收和利用。

2.6.3 培養(yǎng)液pH(見(jiàn)圖8)

由圖8可知，CK和M的pH由初始值6.2緩慢上升，10 d后M的pH趨于平穩(wěn)，而CK的pH繼續(xù)升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)CK和M的pH分別達(dá)到8.45和8.14，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中M的pH始終比CK的低。C和MC由于添加了NaHCO3,其pH初始值較高，培養(yǎng)過(guò)程中C的pH由初始8.2迅速升高至9.9后開(kāi)始逐漸下降，最終穩(wěn)定在8.6；MC的pH在4 d時(shí)升高至10.1后趨于穩(wěn)定，8 d后開(kāi)始緩慢下降，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到8.91。藻類光合自養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，由于藻細(xì)胞對(duì)生理堿性鹽的吸收，導(dǎo)致培養(yǎng)液pH上升。CK的pH緩慢上升主要是由于柵藻對(duì)NaNO3的吸收所致，而M的pH低于CK的pH可能是由于細(xì)菌B1釋放的CO2和分泌的酸性胞外產(chǎn)物造成的。相比之下，C和MC的pH上升是由于柵藻對(duì)NaNO3和NaHCO3的吸收導(dǎo)致的，而整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中MC的pH始終高于C的pH，說(shuō)明MC比C促進(jìn)了NaHCO3的吸收和利用。

圖8 不同培養(yǎng)方式下培養(yǎng)液pH變化曲線

2.6.4 柵藻脂類含量(見(jiàn)表2)

表2 不同培養(yǎng)方式下的柵藻脂類含量、合成速率和比合成速率

由表2可知，與CK相比，M、C、MC體系柵藻的脂類含量，分別提高了35.6%、41.6%、50.4%，脂類合成速率分別提高了133%、189%、354%，脂類比合成速率分別提高了37.4%、45.5%、54.5%。與CK相比，M和C均能提高反應(yīng)體系的C/N，MC的NaNO3質(zhì)量濃度比M和C的低，具有更高的C/N，因而更有利于細(xì)胞內(nèi)碳代謝通量流向脂類合成方向，促進(jìn)了脂類的合成[33]。MC在12 d時(shí)的NaNO3質(zhì)量濃度已降為0，使藻細(xì)胞提前進(jìn)入“氮饑餓”狀態(tài)，而高C/N和“氮饑餓”均能促進(jìn)藻類脂類合成[33-35]。

2.6.5 柵藻脂類的脂肪酸組成(見(jiàn)表3)

由表3可知，柵藻在不同培養(yǎng)方式下的脂類脂肪酸組成基本相同，碳原子數(shù)介于14～22之間，其中C16∶0、C18∶1和C18∶2含量較高。與CK相比，M、C、MC C16∶0含量分別提高20.4%、27.9%、38.3%，C18∶1含量分別提高了17.0%、30.9%、47.4%，C18∶2含量提高了7.1%、14.7%、20.5%。

表3 不同培養(yǎng)方式下柵藻的脂肪酸組成及含量 %

3 結(jié) 論

藻-菌混合培養(yǎng)和添加NaHCO3培養(yǎng)均能提高柵藻的生物量和脂類含量，而添加NaHCO3的藻-菌混合培養(yǎng)則進(jìn)一步提高了柵藻的生物量和脂類含量以及脂類組成中C16∶0、C18∶1和C18∶2的含量。因此，添加NaHCO3的藻-菌混合培養(yǎng)比單獨(dú)的 藻-菌混合培養(yǎng)和添加NaHCO3培養(yǎng)更能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和脂類合成，是一種高效的生物柴油原料生產(chǎn)模式。