徐 蘭 李 青 章紹康 王光輝

(東華理工大學(xué)水資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西 南昌 330013)

藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的第一營養(yǎng)級，具有非常重要的水環(huán)境凈化功能，不僅能去除水環(huán)境中的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，還可吸附、吸收污水中的重金屬和有機污染物[1]。當(dāng)污染物濃度過高或暴露時間過長時，藻細(xì)胞會發(fā)生皺縮、畸變，嚴(yán)重的會出現(xiàn)細(xì)胞裂解而死亡，甚至可通過食物鏈影響人體健康。鉛是一種蓄積性重金屬毒物，分布廣泛、毒性持久，可通過食物鏈富集后對生態(tài)系統(tǒng)以及人體產(chǎn)生毒害作用[2-3]。多環(huán)芳烴(PAHs)是一種持久性有機污染物[4]，其中的菲、芴等先后被美國和中國列為優(yōu)先控制污染物[5]，具有致癌、致畸和致突變[6-7]作用。目前，國內(nèi)外關(guān)于重金屬或多環(huán)芳烴對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的影響報道較多[8-11]。但環(huán)境中的污染物往往不是單獨以一種類別存在的，而是不同種類的污染物共同作用形成復(fù)合污染[12]，如何降低重金屬和有機污染物復(fù)合污染對水生生物的毒性研究還相對較少，尚處于探索階段。

環(huán)糊精(CD)是一類以α-1，4糖苷鍵結(jié)合的環(huán)狀低聚糖，呈錐筒狀。由于這類化合物本身無毒[13-14]、生物降解性好[15]、不易被土壤吸附[16]，正在逐漸成為研究的熱點。常見的CD同分異構(gòu)體有α-CD、β-CD和γ-CD，其中以β-CD應(yīng)用最為廣泛，對β-CD進(jìn)行化學(xué)修飾，可以得到水溶性更好的CD衍生物。徐蘭等[17]用天冬氨酸與β-CD合成了水溶性極好的天冬氨酸-β-CD(ACD)，其對土壤中鎘等重金屬和芴等有機物都具有很好的去除作用。CD及其衍生物主要通過與環(huán)境中的污染物(包括有機污染物和重金屬)形成主客體包結(jié)物和配合物達(dá)到降低或去除其毒性的作用。WANG等[18-19]關(guān)于β-CD及其衍生物的一些研究為解決實際環(huán)境問題提供了重要思路。筆者選用重金屬鉛和PAHs菲作為代表性污染物，研究CD及其衍生物加入前后斜生柵藻與重金屬和有機污染物間的相互作用，旨在揭示CD及其衍生物對降低重金屬和有機污染物的藻類毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：斜生柵藻和BG-11培養(yǎng)基配方由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。

試劑：硫酸鉛、α-CD、β-CD、γ-CD、羥丙基-β-CD(HP-β-CD)、無水甲醇、氫氧化鉀、環(huán)氧氯丙烷、天冬氨酸均為分析純，菲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%，ACD根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法合成。

儀器：XYH-4A型體視顯微鏡，LHP-250型智能人工氣候培養(yǎng)箱，722型可見分光光度計，VS-1300型無菌操作臺，YXQ-LS-50SII型立式高壓蒸汽滅菌鍋，HC-2068型高速離心機。

1.2 培養(yǎng)條件

所用玻璃器皿和培養(yǎng)液、蒸餾水均經(jīng)過121 ℃滅菌20 min，斜生柵藻培養(yǎng)液培養(yǎng)量為100 mL，pH為7.1，所有實驗均在智能人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照強度為2 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，每天振蕩2～3次并隨機更換裝有斜生柵藻培養(yǎng)液的錐形瓶位置。

1.3 實驗方法

1.3.1 斜生柵藻的培養(yǎng)與吸光度的測定

[21]的方法，收到藻種后，在無菌條件下轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶(含30 mL BG-11培養(yǎng)基)內(nèi)，封好瓶口，置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h用可見分光光度計在650 nm處進(jìn)行吸光度(A650)的測定，并在體視顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)得到藻細(xì)胞濃度(N，107個/mL)，從而建立藻細(xì)胞濃度和吸光度之間的相關(guān)關(guān)系(見式(1))，R2=0.992 2，因此可以通過測定A650推算藻細(xì)胞濃度。

N=3.808 3A650+0.059 8

(1)

1.3.2 ACD對斜生柵藻生長的影響

在1.2節(jié)的培養(yǎng)條件下考察新合成的ACD(100 mg/L)對斜生柵藻的影響，以不加任何CD及其衍生物(α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和ACD)的斜生柵藻培養(yǎng)液作為空白對照。

1.3.3 ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響

用硫酸鉛配制兩組0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/L的鉛溶液，將含有ACD(100 mg/L)的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到其中一組鉛溶液中，將沒有加入ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到另一組鉛溶液中，考察ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.4 ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響

由于菲不溶于水，實驗過程中需加入3 mL無水甲醇以增加菲的溶解度，因此單獨考察添加3 mL無水甲醇對斜生柵藻生長的影響，并以添加3 mL蒸餾水的斜生柵藻培養(yǎng)液作為空白，以確定無水甲醇的干擾。

配制兩組0、5、10、20、50、100 μg/L的菲溶液，將含有ACD(100 mg/L)的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到其中一組菲溶液中，將沒有加入ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到另一組菲溶液中，所有溶液中均添加3 mL無水甲醇，考察ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.5 CD及其衍生物對復(fù)合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響

將含有CD及其衍生物質(zhì)量濃度為100 mg/L的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復(fù)合溶液中，將不含CD及其衍生物的斜生柵藻培養(yǎng)液接種到另一份含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復(fù)合溶液中，考察CD及其衍生物對鉛和菲復(fù)合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

藻細(xì)胞的生長速率和抑制率分別根據(jù)以下公式計算：

V=ln(Nt/N0)/t

(2)

I=(V0-V)/V0×100%

(3)

式中：V為藻細(xì)胞的生長速率，h-1；Nt為t時刻的藻細(xì)胞濃度，107個/mL；N0為初始藻細(xì)胞濃度，107個/mL；t為培養(yǎng)時間，h；I為藻細(xì)胞抑制率，%；V0為不加任何CD及其衍生物的斜生柵藻培養(yǎng)液在1.2節(jié)的培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞的生長速率，h-1。

暴露96 h的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)根據(jù)抑制率和暴露濃度的劑量—效應(yīng)關(guān)系得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 ACD對斜生柵藻生長的影響

ACD對斜生柵藻生長的影響如圖1所示。由圖1可見，在相同培養(yǎng)時間下，添加100 mg/L ACD后藻細(xì)胞濃度明顯大于空白對照，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，藻細(xì)胞濃度均逐漸增加，表明ACD對斜生柵藻的生長具有促進(jìn)作用。

圖1 ACD對斜生柵藻生長的影響Fig.1 Effects of ACD on Scenedesmus obliquus

2.2 ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響

鉛對斜生柵藻生長的影響如圖2所示。由圖2可見，在相同培養(yǎng)時間下，鉛質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時藻細(xì)胞濃度幾乎都比0 mg/L時高，說明低濃度的鉛促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，這是因為微量的鉛是藻細(xì)胞自身生長所需的營養(yǎng)元素[22]。當(dāng)鉛質(zhì)量濃度≥0.10 mg/L時，與鉛質(zhì)量濃度為0 mg/L時相比，斜生柵藻的生長均受到了不同程度的抑制；當(dāng)鉛質(zhì)量濃度≥10.00 mg/L時，藻細(xì)胞濃度隨培養(yǎng)時間的延長急劇下降，斜生柵藻的生長完全受到抑制，且隨培養(yǎng)時間的延長抑制作用增強：說明高濃度的鉛對斜生柵藻產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。

圖2 鉛對斜生柵藻生長的影響Fig.2 Effect of Pb on Scenedesmus obliquus

ACD對鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響如圖3所示。與圖2相比，在相同鉛濃度和相同培養(yǎng)時間條件下，含有100 mg/L ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液中藻細(xì)胞濃度基本比不含ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液高。但從圖3來看，鉛質(zhì)量濃度為0.01mg/L時藻細(xì)胞濃度比0 mg/L時低，這可能是ACD與鉛發(fā)生了作用，導(dǎo)致兩者對斜生柵藻生長的促進(jìn)作用均減弱。

圖3 ACD對不同質(zhì)量濃度鉛脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.3 Effect of ACD on Scenedesmus obliquus stressed by Pb of different concentrations

由此可見，由于ACD對斜生柵藻具有促生長作用，因此可以在一定程度上降低高濃度鉛對斜生柵藻的毒性效應(yīng)。

2.3 ACD對菲脅迫下斜生柵藻生長的影響

從圖4可以看出，3 mL無水甲醇對斜生柵藻的生長幾乎沒有影響，從而排除了加入助溶劑對研究菲脅迫下斜生柵藻生長的干擾。

圖4 甲醇對斜生柵藻生長的影響Fig.4 Effect of methanol on Scenedesmus obliquus

菲對斜生柵藻生長的影響如圖5所示。從圖5可以看出，與重金屬鉛對斜生柵藻生長的影響類似，菲質(zhì)量濃度為5 μg/L時藻細(xì)胞濃度比0 μg/L時高，說明低濃度的菲不僅不會抑制斜生柵藻的生長，反而會促進(jìn)其藻細(xì)胞的生長。當(dāng)菲質(zhì)量濃度≥10 μg/L時，與菲質(zhì)量濃度為0 μg/L時相比，斜生柵藻的生長都受到了不同程度的抑制；當(dāng)菲質(zhì)量濃度為100 μg/L時，斜生柵藻的生長完全受到抑制：說明高濃度的菲對斜生柵藻產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。金香琴等[23]在研究菲脅迫下美人蕉對斜生柵藻生長的影響時也觀察到這種“低促高抑”的現(xiàn)象。原因可能是斜生柵藻能利用低濃度的菲作為碳源，但隨著菲濃度的升高，菲的毒性效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，超過了斜生柵藻的承受極限，出現(xiàn)中毒癥狀。

圖5 菲對斜生柵藻生長的影響Fig.5 Effect of phenanthrene on Scenedesmus obliquus

ACD對不同質(zhì)量濃度菲脅迫下斜生柵藻生長的影響如圖6所示。與圖5相比，在相同菲濃度和相同培養(yǎng)時間條件下，含有100 mg/L ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液中藻細(xì)胞濃度均比不含ACD的斜生柵藻培養(yǎng)液高，說明ACD分子能夠與有機污染物發(fā)生作用，使菲的毒性降低。但從圖6來看，菲質(zhì)量濃度為5 μg/L時藻細(xì)胞濃度基本比0 μg/L時低，這也是因為ACD與菲發(fā)生了相互作用，從而導(dǎo)致兩者對斜生柵藻的促進(jìn)作用均減弱。從ACD的分子結(jié)構(gòu)分析，是因為其內(nèi)部具有立體空腔結(jié)構(gòu)，能夠以類似于細(xì)胞吞噬的方式將有機物包結(jié)于腔體內(nèi)。

圖6 ACD對不同質(zhì)量濃度菲脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.6 Effect of ACD on Scenedesmus obliquus stressed by phenanthrene of different concentrations

2.4 CD及其衍生物對復(fù)合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響

在含有1.00 mg/L鉛和10 μg/L菲的復(fù)合污染脅迫下，不同CD及其衍生物對斜生柵藻生長的影響如圖7所示。由圖7可知，CD及其衍生物都能降低鉛和菲復(fù)合污染對斜生柵藻的毒性效應(yīng)，但不同的CD及其衍生物對降低鉛和菲復(fù)合污染的毒性效應(yīng)效果不同，表現(xiàn)為ACD>HP-β-CD>β-CD>γ-CD>α-CD。這是因為CD分子對菲的包結(jié)作用與CD空腔大小有關(guān)，其中β-CD的腔體大小(0.79 nm)與菲分子大小(0.79 nm)最為匹配，結(jié)合最為牢固，而γ-CD腔體直徑較大(0.80 nm)，包結(jié)的菲有可能漏出，α-CD腔體直徑較小(0.78 nm)，不能完全包結(jié)菲分子。CD衍生物由于增加了新的基團(tuán)，除空腔結(jié)構(gòu)可以包結(jié)菲外，還能與重金屬鉛發(fā)生配位作用，且ACD中的氨基、羧基對鉛的配位能力比HP-β-CD中的羥基強。

圖7 CD及其衍生物對復(fù)合污染脅迫下斜生柵藻生長的影響Fig.7 Effect of CD and its derivatives on Scenedesmus obliquus stressed by combined pollution

2.5 ACD對污染物脅迫下斜生柵藻相關(guān)指標(biāo)的影響

根據(jù)劑量—效應(yīng)關(guān)系得到，加入100 mg/L ACD可以使鉛對斜生柵藻96 h的EC50由0.96 mg/L增加到了3.79 mg/L，菲對斜生柵藻96 h的EC50由40 μg/L增加到104 μg/L，進(jìn)一步證明了ACD可以降低鉛或菲等污染物對斜生柵藻的毒性效應(yīng)。

從表1來看，100 mg/L ACD可以使鉛對斜生柵藻的藻細(xì)胞抑制率由58%下降到29%，菲對斜生柵藻的藻細(xì)胞抑制率由13%下降到5%；在鉛和菲的復(fù)合污染下，藻細(xì)胞抑制率明顯增強，在不含CD及其衍生物和含100 mg/L ACD的情況下藻細(xì)胞抑制率分別為88%、57%，說明鉛和菲的復(fù)合污染表現(xiàn)出協(xié)同作用，ACD也能降低鉛和菲復(fù)合污染對斜生柵藻的毒性效應(yīng)。

表1 ACD對污染物脅迫下斜生柵藻藻細(xì)胞抑制率的影響

3 結(jié) 論

(1) 鉛和菲對斜生柵藻的生長都表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象。當(dāng)鉛質(zhì)量濃度≥0.10 mg/L或菲質(zhì)量濃度≥10 μg/L時，斜生柵藻的生長都受到不同程度的抑制。

(2) ACD對斜生柵藻的生長具有促進(jìn)作用，從而可以降低鉛和菲對斜生柵藻的毒性效應(yīng)。質(zhì)量濃度為100 mg/L的ACD可以顯著降低鉛和菲的藻類毒性。

(3) 比較不同CD及其衍生物對降低鉛和菲復(fù)合污染的毒性發(fā)現(xiàn)，效果優(yōu)劣表現(xiàn)為ACD>HP-β-CD>β-CD>γ-CD>α-CD。

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