林 濤，樊建麟，魏茂瓊，楊東順，劉興勇，李彥剛，劉宏程*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,云南昆明 650223；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(昆明),云南昆明 650223)

野生菌因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美而受到了國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛，但食用菌易長(zhǎng)蟲，儲(chǔ)藏時(shí)間短，而在食用菌上噴灑殺蟲劑、防腐劑等可以延長(zhǎng)貨架期。目前，食用菌中檢出農(nóng)藥的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[1]。甲拌磷(Phorate)屬高毒農(nóng)藥，是目前在食用菌中常檢出的殺蟲劑之一，過量攝入后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，呼吸衰竭等危險(xiǎn)[2]。甲拌磷在自然條件下經(jīng)過氧化反應(yīng)后會(huì)生成毒性更大的甲拌磷砜(Phorate Sulfone)和甲拌磷亞砜(Phorat-sulfoxide)[3]。甲拌磷及其代謝物的測(cè)定通常采用氣相色譜[4]和氣-質(zhì)聯(lián)用[5,6]的方法，但是這些方法的前處理復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)，不利于甲拌磷及其代謝物的快速篩查。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其快速方便、前處理簡(jiǎn)單而廣泛應(yīng)用于甲拌磷的快速篩查中[7,8]，但是目前還沒有野生菌中甲拌磷及其代謝物等的快速測(cè)定方法。

目前，云南野生菌中還未出現(xiàn)甲拌磷檢出的情況，但野生菌常生長(zhǎng)在樹叢中，周圍通常都會(huì)種植經(jīng)濟(jì)植物，其在種植過程中使用的農(nóng)藥可能會(huì)隨著雨水、風(fēng)等自然作用而遷移至野生菌上；另一方面，野生菌的基質(zhì)比常規(guī)食用菌復(fù)雜，甲拌磷在野生菌的復(fù)雜基質(zhì)中可能會(huì)快速轉(zhuǎn)化成代謝物而不易檢出，而目前對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中都未對(duì)甲拌磷的代謝物進(jìn)行規(guī)定。因此，建立野生菌中甲拌磷及其代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法十分重要。

本實(shí)驗(yàn)選取松茸、牛肝菌和雞樅等典型的云南野生菌為研究對(duì)象，優(yōu)化了QuEChERS法，結(jié)合質(zhì)譜理論研究了甲拌磷及其代謝物的斷裂機(jī)理，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立快速準(zhǔn)確的云南野生菌中甲拌磷及其代謝物的測(cè)定方法?？蔀樵颇弦吧懈叨巨r(nóng)藥的測(cè)定提供理論依據(jù)，也為云南野生菌的順利出口提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB公司)；1290超高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；AE100電子分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；TGL-15B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；渦旋振蕩器(美國(guó)，Thermo Scientific公司)。

甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，1 mL，中國(guó)百靈威科技)。分別將甲拌磷、甲拌磷砜和甲拌磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶，用甲醇定容得到1 μg/mL的甲拌磷及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃下避光保存。無水MgSO4、NaCl、NH4Ac(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；HAc(色譜純，美國(guó)Fluka公司)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；ProElut PSA、NH2、C18、Florisil填料(50 μm，中國(guó)迪馬科技)。純凈水(杭州娃哈哈公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品提取與凈化在50 mL離心管中，準(zhǔn)確稱取經(jīng)食品粉碎機(jī)粉碎混勻后的野生菌樣品10 g，加入20 mL的1% HAc-乙腈，1 g NaCl和4 g無水MgSO4，渦旋提取5 min后5 000 r/min下離心3 min，取上清液2 mL于預(yù)先加入60 mg PSA和50 mg無水MgSO4的離心管中，渦旋提取15 s，取上層提取液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.2儀器條件色譜條件：Agilent ZORBAX RRHD色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為1 mmol/L NH4Ac水溶液(含0.1%甲酸)。梯度洗脫條件：0～5.00 min，20%～90%A；5.00～6.00 min，90%A；6.00～6.10 min，90%～20%A；6.10～7.00 min，20%A。流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL。質(zhì)譜條件：ESI源，氣簾氣流速為20 L/min，霧化氣流速為55 L/min，輔助氣流速為55 L/min，輔助加熱氣溫度為550 ℃，噴霧電壓為5 500 V，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)。

1.2.3定性和定量測(cè)定在上述相同的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，當(dāng)檢出的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致時(shí)，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品的離子豐度比相一致時(shí)(相對(duì)豐度>50%時(shí)，允許±20%偏差；相對(duì)豐度>20%～50%時(shí)，允許±25%偏差；相對(duì)豐度>10%～20%時(shí)，允許±30%偏差；相對(duì)豐度≤10%時(shí)，允許±50%偏差)，則可判斷野生菌樣品中存在甲拌磷及其代謝物。定量測(cè)定時(shí)采用外標(biāo)法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

將甲拌磷及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，利用針泵進(jìn)樣，分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的掃描，確定其母離子和子離子，并優(yōu)化其解簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)，以達(dá)到最大的響應(yīng)值。甲拌磷及其代謝物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓如表1所示。

表1 甲拌磷及其代謝物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓

* Quantitative ion.

實(shí)驗(yàn)中首先采用甲醇-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲拌磷及其代謝物的峰形不太對(duì)稱，當(dāng)在水相中加入1 mmol/L 的NH4Ac(含0.1%的甲酸)后，甲拌磷及其代謝物的峰形變得對(duì)稱且較之前響應(yīng)值明顯增大，分析原因可能為甲酸的加入可以使溶液環(huán)境中的H+增多，促進(jìn)目標(biāo)化合物帶正電荷，同時(shí)NH4Ac的加入也可抑制[M+Na]+而促進(jìn)[M+H]+的產(chǎn)生，提高化合物的離子化效率，利于二級(jí)碎片的產(chǎn)生；同時(shí)NH4Ac的加入也在一定程度上調(diào)節(jié)了流動(dòng)相環(huán)境中的離子強(qiáng)度，使色譜峰形更對(duì)稱，從而提高了色譜峰的響應(yīng)值，甲拌磷及其代謝物的色譜圖如圖1所示。

2.2 子離子斷裂方式推導(dǎo)

甲拌磷和甲拌磷亞砜的結(jié)構(gòu)中都含有C-S鍵，且甲拌磷亞砜比甲拌磷在結(jié)構(gòu)上多了一個(gè)S=O，因此在ESI源的碰撞電壓作用下，甲拌磷和甲拌磷亞砜中共有的C-S鍵斷裂而生成共同的m/z143.95的二級(jí)碎片；同時(shí)，甲拌磷亞砜和甲拌磷砜中都含有S-C鍵和P-O鍵等不穩(wěn)定的化學(xué)鍵，在碰撞電壓的作用下，甲拌磷亞砜和甲拌磷砜中共有的S-C鍵和P-O鍵斷裂，因而都產(chǎn)生了m/z96.93的二級(jí)碎片，可能的斷裂方式推導(dǎo)如圖2所示。

2.3 QuEChERS的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑酸性的選擇實(shí)驗(yàn)中比較了乙腈與1% HAc-乙腈作為提取溶劑的不同效果，如圖3所示，乙腈對(duì)于甲拌磷及其代謝物的提取效果較差，當(dāng)在乙腈中加入1%的HAc后，提取率明顯上升，表明甲拌磷及其代謝物在溶液中呈現(xiàn)出一定的酸性，根據(jù)相似相溶的原理，酸性乙腈能夠充分的溶解甲拌磷及其代謝物，從而提高了提取效率。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇1%HAc-乙腈作為甲拌磷及代謝物的提取溶劑。

2.3.2凈化填料的選擇實(shí)驗(yàn)中比較了PSA、NH2、C18和Florisil對(duì)于野生菌中甲拌磷及其代謝物的不同凈化效果，如圖4所示。結(jié)果表明，4種填料對(duì)于甲拌磷砜的提取效果都較好。對(duì)于甲拌磷亞砜，除C18的提取效果較差，其余3種的提取效果較好；而對(duì)于甲拌磷，只有PSA的提取效果較好，能夠達(dá)到70%以上。綜合考慮，選擇PSA作為野生菌中甲拌磷及其代謝物的凈化填料。

2.3.3凈化填料加入量的選擇比較了不同PSA的加入量對(duì)于甲拌磷及其代謝物提取效果的影響，如圖5所示。結(jié)果表明，不同的PSA加入量對(duì)于甲拌磷和甲拌磷亞砜的提取效果影響不大，但是對(duì)于甲拌磷砜的影響較大，當(dāng)加入量較少時(shí)，不能完全吸附干擾的雜質(zhì)而存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而當(dāng)加入量過多時(shí)，又會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物具有一定程度的吸附，從而影響了提取效率。綜合考慮，選擇PSA的加入量為60 mg為最佳。

2.3.4無水MgSO4加入量的選擇本實(shí)驗(yàn)中還分別比較了分別加入50、100、200、300、400 mg無水MgSO4時(shí)對(duì)于野生菌中甲拌磷及其代謝物提取效果的影響。結(jié)果表明，不同無水MgSO4加入量對(duì)于甲拌磷的提取效果相差不大，因此選擇無水MgSO4的加入量為50 mg，以節(jié)省試劑。

2.4 野生菌樣品中甲拌磷及其代謝物的定量方法

2.4.1線性范圍、檢出限和定量限分別將甲拌磷及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液利用甲醇稀釋成不同的濃度，以峰面積對(duì)其各自的濃度進(jìn)行線性范圍的考察；利用野生菌的空白基質(zhì)，通過甲拌磷及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)添加的方法，以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別確定檢出限和定量限。如表2所示，甲拌磷及其代謝的相關(guān)系數(shù)較好，且檢出限較低，滿足日常檢測(cè)中對(duì)于農(nóng)藥殘留分析的要求。

表2 甲拌磷及其代謝物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限和定量限

2.4.2方法的精密度和準(zhǔn)確度本實(shí)驗(yàn)中分別以松茸、牛肝菌和雞樅作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別以1倍、5倍和10 倍定量限作為3個(gè)添加濃度進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做6次平行試驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，甲拌磷及其代謝物的平均回收率范圍為73.3%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為4.4%～9.9%。

表3 甲拌磷及其代謝物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4.3實(shí)際樣品的測(cè)定通過對(duì)云南省內(nèi)采集的60個(gè)野生菌樣品(其中松茸、牛肝菌和雞樅各20個(gè))進(jìn)行甲拌磷及其代謝物的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，60個(gè)樣品均未檢測(cè)出甲拌磷及其代謝物，表明目前在云南省內(nèi)所采集的野生菌安全性較好。

3 小結(jié)

本文利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，結(jié)合QuEChERS法，建立了云南野生菌中甲拌磷及其代謝物的快速提取和測(cè)定方法。以1% HAc-乙腈作為提取溶液，PSA填料凈化，采用正離子MRM模式監(jiān)測(cè)，外標(biāo)法定量，方法具有較好的準(zhǔn)確度和精確度，適合云南野生菌中甲拌磷及其代謝物的快速分析測(cè)定。