孫曉杰，李兆新*，董 曉,3，邢麗紅， 周德山，宋新成

(1.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071;2.國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,山東青島 266071;3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306；4.江蘇省連云港市海洋環(huán)境監(jiān)測預(yù)報中心，江蘇連云港 222001)

隨著畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，動物疾病頻發(fā)，用來預(yù)防和治療疾病的抗生素種類和用量也在日益增加。水環(huán)境中抗生素主要來源于抗生素工業(yè)廢水、醫(yī)用抗生素(醫(yī)院和家庭使用的抗生素)和獸用抗生素等[1]。水環(huán)境中抗生素污染不僅影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還進(jìn)一步威脅著生態(tài)環(huán)境安全[2 - 4]。由于目前醫(yī)藥生產(chǎn)和養(yǎng)殖使用的抗生素種類繁多，導(dǎo)致水環(huán)境中抗生素污染成分復(fù)雜。同時其在大量水體中多以痕量或超痕量存在,加之浮游生物及微小顆粒等對測定存在不同的干擾,因此水環(huán)境中抗生素的提取分析技術(shù)是影響其污染效應(yīng)研究的關(guān)鍵因素。目前用于檢測抗生素殘留的分析方法有高效液相色譜法[5 - 7]、氣相色譜法[8]、酶標(biāo)法[9,10]、色-質(zhì)聯(lián)用法[11,12]等,研究報道主要集中于食品基質(zhì)的檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域,用于海水等環(huán)境水樣中抗生素的檢測方法關(guān)注較少,且痕量檢測用常規(guī)色譜法無法達(dá)到要求，檢測種類也僅限于一種或幾種[13 - 16]。因此，急需建立水中多類多種抗生素殘留的快速檢測方法。固相萃取技術(shù)(SPE)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)可以對目標(biāo)物準(zhǔn)確定性定量，是目前水環(huán)境中抗生素多殘留檢測的主要技術(shù)。

本研究選擇養(yǎng)殖過程中常用的8種磺胺類、3種喹諾酮類、3種氯霉素類和4種四環(huán)素類抗生素作為研究對象,采用SPE技術(shù)對目標(biāo)物進(jìn)行富集濃縮,HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測,建立了水樣中痕量抗生素多殘留的高靈敏檢測方法,從而實(shí)現(xiàn)了水環(huán)境中抗生素污染水平的快速篩查。本方法與相同儀器條件測試的其他報道相比[13,14]，靈敏度得到不同程度提高。并將所建立的方法應(yīng)用于實(shí)際海域環(huán)境水樣中抗生素多殘留的調(diào)查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ QuantumAccessTM 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；Talboys型旋渦混合器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；BT224S分析天平(法國，Sartorius公司)；N-EVAPTM112型氮?dú)獯祾邇x(美國，Organomation公司)；Milli-Q 型超純水儀(美國，Millipore公司)。固相萃取裝置(美國，Supelco公司)；AUQA LOADER 698全自動上樣裝置(日本，島津公司)；C18小柱(200 mg/3mL，美國，Waters公司)，PPL小柱(200 mg/3mL，美國，安捷倫公司)，PLS-3小柱(200 mg/6mL，日本，島津公司)。

氯霉素(純度98.5%)、甲砜霉素(純度98.5%)、氟甲砜霉素(又名氟苯尼考，純度99.5%)、磺胺嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲基嘧啶(純度99.2%)、磺胺二甲基嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲噁唑(純度99.5%)、磺胺二甲異噁唑(純度98.7%)、磺胺噻唑(純度99.5%)、磺胺多辛(純度99.0%)、磺胺喹噁啉(純度97.5%)、諾氟沙星(純度99.5%)、環(huán)丙沙星(純度95.0%)、恩諾沙星(純度98.5%)、土霉素(純度97.5%)、金霉素(純度99.0%)、四環(huán)素(純度98.0%)、強(qiáng)力霉素(純度98.7%)，所有標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈、甲醇為色譜純(Merk公司)；甲酸為色譜純(Fluka公司)。標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃ 保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液：分別取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

海水樣品采自青島黃海近岸海域。

1.2 樣品處理

海水樣品取自水面下0.5 m處。首先用0.45 μm水系濾膜除去懸浮顆粒，再用稀HCl調(diào)節(jié)水樣pH至4.0左右，然后取500 mL水樣以5 mL/min流速通過PLS-3固相萃取小柱進(jìn)行富集和凈化。小柱上樣之前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化。水樣過完柱后，用3 mL水淋洗，減壓抽干后用6 mL甲醇分2次洗脫，洗脫液在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，? mL初始流動相定容，充分渦旋溶解殘?jiān)?濾液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，待上機(jī)分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters C18色譜柱(150×2.1 mm，3 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液；B為0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%～70%B；3.0～5.0 min，70%～90%B；5.0～8.0 min，90%B；8.0～9.0 min，90%～10%B；9.0～10.0 min，10%B；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫：35 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子模式；氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素選擇負(fù)離子檢測，噴霧電壓為4.2 kV，其他抗生素類選擇正離子檢測，噴霧電壓為3.5 kV；鞘氣和輔助氣體均為高純氮?dú)?，鞘氣流速?0 L/min，輔助氣流速：5 L/min，碰撞氣為氦氣，誘導(dǎo)解離電壓為10 V；離子傳輸桿溫度為350 ℃。碰撞能及抗生素的其他相關(guān)質(zhì)譜條件見表1。

表1 18種抗生素的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

* quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

2.1.1固相萃取小柱的選擇18種目標(biāo)抗生素皆為極性化合物，多采用SPE柱富集，去除基質(zhì)中雜質(zhì)干擾，并獲得較高的回收率。本研究考察了C18、PPL和PLS -3三種不同SPE小柱對目標(biāo)物的萃取效果(圖1)，每個小柱在優(yōu)化條件下各做3個平行。研究結(jié)果表明，采用PLS -3 SPE柱時18種物質(zhì)的響應(yīng)都較高，且對各組分的回收率較為理想，均達(dá)到70.0%以上，重現(xiàn)性好，因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇PLS -3 SPE柱。

2.1.2上樣pH值優(yōu)化以500 mL空白海水為基底，分別調(diào)整pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，然后加入目標(biāo)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻后參照1.2方法進(jìn)行上樣處理，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明pH值對氯霉素類的回收率影響較小，但對于磺胺類、沙星類和四環(huán)素類，當(dāng)pH為4.0時，目標(biāo)抗生素的回收率普遍較高，重現(xiàn)性較好。因此，本研究選擇上樣溶液的pH為4.0。

2.1.3洗脫溶劑及洗脫量優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈和80%甲醇水對目標(biāo)抗生素類的洗脫效果，結(jié)果表明甲醇對各種抗生素的洗脫能力最強(qiáng)。同時分別優(yōu)化4.0、6.0、8.0、10.0 mL幾種不同洗脫量對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分兩次洗脫，總洗脫量是6.0 mL時對目標(biāo)物的回收率已經(jīng)達(dá)到70%以上，當(dāng)洗脫量超過6.0 mL后，回收率沒有明顯增加。因此本實(shí)驗(yàn)選擇6.0 mL甲醇分兩次洗脫。

2.2 檢出限、回收率和精密度

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用初始流動相配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以每種目標(biāo)物定量離子的峰面積與質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表2可以看出，18種抗生素在對應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。本文采用向空白海水中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，取樣500 mL，得到方法對18種抗生素的檢出限(LOD，按S/N=3計算)為1.0～10.0 ng/L，回收率在70.0%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差皆小于10%，說明方法的準(zhǔn)確性和靈敏度較高，重現(xiàn)性好，適合于水樣中抗生素多殘留的同時檢測。

表2 海水中添加抗生素的回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

2.3 樣品測定

分析了采自青島黃海近岸不同海域的5份海水樣品。結(jié)果表明，5個樣品中都未檢測到18種抗生素殘留，可能原因主要有：自然海域面積較大,對抗生素等污染有更好的稀釋作用；同時海水流動交換能力強(qiáng)，有一定的自清潔能力；另外，抗生素進(jìn)入水體后，大部分被底泥等沉積物吸附，會降低其在海水中的濃度。通過實(shí)際樣品測定表明，本研究方法對于海水基質(zhì)凈化效果較好，可拓展適用于其他水樣中抗生素多殘留的測定。

3 結(jié)論

本方法利用固相萃取技術(shù)同時富集海水中的18種抗生素藥物,并建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器檢測方法。結(jié)果表明方法具有較高的靈敏度，檢出限在1.0～10.0 ng/L之間；同時選用三個不同濃度的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，回收率為71.6%～117%，方法的重現(xiàn)性較好，可以滿足當(dāng)前對環(huán)境水樣中抗生素多殘留快速篩查的要求。方法成功應(yīng)用于黃海近岸海域海水中抗生素多殘留的分析，并將拓展應(yīng)用于養(yǎng)殖海域和污染水源抗生素多殘留的快速篩查。