滑志民，張似青，趙熠群，張陳華，曾　暉，杜　波

(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)系，上海 201699)

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液氮蒸汽熏蒸時間對犬精子冷凍效果的影響

滑志民，張似青，趙熠群，張陳華，曾暉，杜波

(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)系，上海 201699)

本試驗研究了0.5 mL細管冷凍保存犬精液過程中液氮熏蒸時間對精子冷凍效果的影響。試驗分為5組，將精液細管置于液氮液面上方2 cm處，分別熏蒸0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、8 min。解凍后通過活率、活力、畸形率及頂體完整率對精子進行評估。結(jié)果：液氮蒸汽熏蒸0 min和1 min組精子活率和活力顯著低于其它各組(P<0.05)。與直接投入液氮相比，在液氮蒸汽中預(yù)冷凍超過2 min能夠提高精子頂體完整率(P<0.05)。本試驗表明在使用0.5 mL細管冷凍犬精子時，液氮熏蒸時間在4～8 min較為適宜。

犬；精子冷凍；液氮熏蒸

犬精子冷凍技術(shù)可有效解決名貴種公犬稀少，跨地域配種，種公犬因腿傷不能配種等問題，還可充分發(fā)揮種公犬的繁殖潛能，加快優(yōu)良基因的擴散及種質(zhì)資源保存等。在我國，犬采用冷凍精液人工授精還沒有廣泛開展，但也有一些研究和嘗試。在精液冷凍過程中降溫速度是影響冷凍效果的重要因素之一，有些研究已經(jīng)開始用程序降溫冷凍儀來精確控制冷凍降溫速度和過程，但多數(shù)還是用液氮熏蒸法冷凍犬的精液，該法操作簡單，無需特殊冷凍設(shè)備。本試驗就液氮熏蒸時間對犬精子冷凍效果進行了研究。

1　材料與方法

1.1試驗動物

試驗犬為中型畢格公犬5只，2～6歲，健康，繁殖性能良好，均能正常采精。飼養(yǎng)于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗動物場，犬舍帶有運動場，每日飼喂兩次商品犬糧，自由飲水。

1.2主要器材和試劑

0.5 mL細管(富士平)、顯微鏡(SMZ745，尼康公司)、顯微鏡用恒溫板(HW-1，金壇市宏華儀器廠)，自動精液分析儀(北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司)、恒溫臺(QB2000，海南其林貝爾儀器制造有限公司)、電熱恒溫水浴箱(HH-W420金壇市醫(yī)療儀器廠)、電子天平(AL204，梅特勒-托利多公司)。冷凍液配制所需藥品及試劑均購自Sigma公司。

1.3精液采集

采用按摩法采精，每3 d采精1次。采精前用37°C無菌生理鹽水清洗包皮內(nèi)外，然后用一只手握住陰莖龜頭球部位進行反復(fù)按摩，待其陰莖充分勃起射精后，另一手持無菌燒杯收集乳白色富含精子的部分。將燒杯中的精液轉(zhuǎn)移入無菌離心管，置于37°C水浴中保溫。經(jīng)鏡檢，活力達到0.7以上為合格精液，用于試驗研究[1]。

1.4精液冷凍保護液的配制

將2.4 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，1.4 mg/mL檸檬酸，0.8 g葡萄糖，5萬IU青霉素，5萬IU鏈霉素溶于100 mL純水中，用磁力攪拌器攪拌30 min混合均勻，過濾除菌備用。上述溶液配好后加入20%的卵黃和5%的甘油配成精液稀釋液。

1.5精液稀釋與冷凍

將采集的所有精液混合，精液密度儀測定密度，按照稀釋后密度為8×107個/mL來計算稀釋倍數(shù)，采用二次稀釋法立即稀釋。首先將已預(yù)熱到37°C的稀釋液緩慢地注入到含有鮮精的試管中，精液與稀釋液比例為1∶1，緩慢搖勻后放入4 ℃冰箱平衡1.5 h，從冰箱中取出，加入4°C稀釋液，最終精子的密度調(diào)整為8×107個/mL，再次放入4 ℃冰箱平衡30 min，精液分裝于0.5 mL的細管中，封口，做好標記，準備冷凍。

精液冷凍采用液氮熏蒸法預(yù)冷，將裝入精液的細管置于冷凍架上，細管與液氮面保持2 cm。根據(jù)試驗設(shè)計設(shè)置不同的熏蒸時間，熏蒸后投入液氮中保存1周以上。

1.6精液的解凍與質(zhì)量評定

將細管從液氮中取出，迅速投入37 ℃的水浴中，保持20 s解凍，顯微鏡下檢測精子活率和活力，通過Giemsa染色檢查精子畸形率和頂體完整率[1]。

1.7試驗設(shè)計

試驗分為5組，根據(jù)細管在液氮蒸汽中熏蒸時間的不同分為：0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、6 min和8 min組。冷凍好的精子解凍后，檢查其活率、活力、畸形率和頂體完整率，來確定較適當(dāng)?shù)难魰r間。每組取3只細管解凍檢查，數(shù)據(jù)以3次平均值來表示。

1.8數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excel軟件中的方差分析。

2　結(jié)果

通過表1可看出，液氮蒸汽預(yù)冷凍2 min、4 min、8 min三組間精子活率和精子活力沒有顯著差異(P>0.05)，而三組均極顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.01)，顯著高于液氮蒸汽熏蒸1 min組。同時液氮蒸汽熏蒸1 min組的精子活率和精子活力均顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.05)。

表1液氮蒸汽熏蒸時間對精子活動力的影響

液氮蒸汽熏蒸時間/min01248精子活率/%3.26±0.58aA23.09±2.21bAB41.95±5.84cB49.20±3.96cB48.73±4.57cB精子活力/%2.48±0.39aA18.73±1.88bAB33.52±3.28cB42.83±4.02cB42.49±4.13cB

注：同一行內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同一行內(nèi)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表2液氮蒸汽熏蒸時間對精子頂體和形態(tài)的影響

形態(tài)檢查液氮蒸汽熏蒸時間/min01248頂體完整率/%26.59±3.56a37.93±5.79a58.46±5.73b61.18±5.04b60.62±3.68b畸形率/%29.39±2.87a31.76±2.02a33.58±3.37a35.37±3.52a36.21±3.98a

注：同一行內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，在頂體完整率方面，液氮蒸汽熏蒸2 min、4 min、8 min三組無顯著差異(P>0.05)，但三組均比液氮蒸汽熏蒸1 min和0 min組有顯著升高(P<0.05)?；温史矫?，各組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

3　討論

本試驗表明，在使用0.5 mL細管冷凍保存犬精液時，熏蒸0 min，即直接投入液氮，解凍后精子存活率和精子活力極低，分別只有3.26%和2.48%。而樣品即使在液氮蒸汽中熏蒸1 min，精子運動能力也顯著提高，精子存活率和精子活力達到了23.09%和18.73%，在液氮蒸汽預(yù)冷凍大于2 min，效果更顯著，精子活率達40%以上。這表明過于快速的降溫對精子會造成致死性的損傷。在熏蒸2 min以上各組精子頂體完整率較直接投入液氮也有顯著提高。精子的頂體是覆蓋于精子核前2/3以上區(qū)域的囊性結(jié)構(gòu)，冷凍過程會導(dǎo)致精子質(zhì)膜和頂體受到不同程度的損傷。有研究認為冷凍對犬精子頂體結(jié)構(gòu)破壞較牛精子更為嚴重，主要表現(xiàn)為頂體的空泡化和膨脹[3]。本試驗表明，將犬精液細管不經(jīng)液氮蒸汽預(yù)冷凍，直接投入液氮，對精子頂體會造成較嚴重的損傷。在精液冷凍過程中，如果降溫速度太快，大量的水分會滯留在細胞中，導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的形成，細胞膜受損，進而死亡。另外一方面，如果降溫速度太慢，細胞外液先形成冰晶，細胞內(nèi)水分子會向細胞外流動，細胞可能皺縮，胞內(nèi)溶質(zhì)濃度過高，也會對精子造成損害?？傊线m的降溫速度是精液冷凍成功的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)然，降溫速度通常還與細管的容量、冷凍保護液的成分、熏蒸時細管距液氮面的高度等因素有關(guān)。

本試驗表明，在使用0.5 mL細管冷凍犬精子時，細管在距液氮面2 cm的情況下，液氮熏蒸時間不應(yīng)低于2 min，推薦熏蒸時間在4～8 min較為適宜。

[1]高雅，羅桂河，李衛(wèi)東，等.不同濃度乙二醇和甘油對犬精液冷凍效果的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26(8)：25-28.

[2]劉璐，張劭俁，張彧，等.犬常規(guī)冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽的研究[J].北京農(nóng)業(yè)，2010，4月下旬刊：1-9.

[3]Luberda Z.The role of glutathione in mammalian gametes[J].Reprod Biol，2005，5(1)：5-17.

2016-05-27

上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)科研課題(091124)

滑志民(1979-)，男，碩士，講師。研究方向：動物繁殖調(diào)控與胚胎工程。

E-mail：huazhimincn@163.com

S829.2

A

1005-2739(2016)05-0014-03