陳明明，王開(kāi)林，楊林昆，李林輝，王寶英，王福兄，郝志明

(天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，天津 300384)

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-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存豬精液的初步研究

陳明明，王開(kāi)林，楊林昆，李林輝，王寶英，王福兄，郝志明

(天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，天津 300384)

本試驗(yàn)從細(xì)管規(guī)格、基礎(chǔ)稀釋液成分(檸檬酸和甘氨酸)、甘油濃度和解凍方法對(duì)豬精液在-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存凍后精子存活率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：(1)0.25 mL和0.5 mL細(xì)管之間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)，其凍后存活率均達(dá)到0.57左右。(2)冷凍液中甘油濃度為3%時(shí)，凍后豬精子存活率最高，達(dá)0.50±0.035；基礎(chǔ)液中檸檬酸的含量為1.3%時(shí)，精子的凍后存活率極顯著高于1.7%時(shí)(P<0.01)；基礎(chǔ)液中甘氨酸的含量為7.5 mg/mL時(shí)，則不能影響精子的凍后存活率(P>0.05)。(3)解凍方法為61 ℃ 5 s時(shí)，精子凍后存活率最高，達(dá)0.61±0.055。

豬精液；-80 ℃超低溫冰箱；細(xì)管規(guī)格；檸檬酸；甘氨酸；甘油濃度；解凍方法

1776年，Spallanazani將青蛙、馬和人類(lèi)的精液置于雪中以嘗試?yán)鋬霰４鎇1]。此后，精液0 ℃以下保存的研究受到了廣泛的關(guān)注。直到1949年，Polge等[2]發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)精子具有抗凍保護(hù)作用后，精液的冷凍保存技術(shù)才取得了重大的突破，并于1956年，首次成功冷凍保存了豬精液[3]。但此后多年，由于豬精子對(duì)低溫更加敏感，以及豬輸精量大和常溫保存較為成功，使豬精液的冷凍保存研究和應(yīng)用停滯不前。近些年來(lái)，隨著低溫生物學(xué)以及牛、犬等動(dòng)物精子冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，豬精子冷凍保存的研究明顯增多，效果顯著提高，凍后存活率超過(guò)0.5的研究報(bào)道比比皆是[4～7]。精液冷凍保存的方法有采用液氮作為冷源的，也有用干冰作為冷源的。本試驗(yàn)以-80 ℃超低溫冰箱為冷源，對(duì)豬精液的冷凍保存進(jìn)行了初步研究，以期探索其可行性及其效果。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑

超低溫冰箱(DW-86L386，青島海爾股份有限公司)，恒溫水槽(ZSBB-712，上海智城分析儀器制造有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)(Novon公司)，甘氨酸(Gly)、檸檬酸(CA)和甘油(均來(lái)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng))。

1.2精液的來(lái)源

豬鮮精來(lái)自于天津市警備區(qū)種豬場(chǎng)。毛巾包裹運(yùn)輸，1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并置于17 ℃恒溫箱中待用。

1.3稀釋液的制備

基礎(chǔ)稀釋液配方：Tris 3.04%，檸檬酸1.30%或1.70%，葡萄糖1.25%，青霉素0.06%，鏈霉素0.10%，雙蒸水100 mL。添加甘氨酸組中，其添加量為7.5 mg/mL。

稀釋I液：為含有20%新鮮卵黃的基礎(chǔ)稀釋液。

稀釋II液：為含有4%、6%或8%甘油的稀釋I液。

1.4稀釋與平衡

取4 mL精液于離心管，2 000 r/min離心4 min，去上清液。加入2 mL等溫的稀釋I液并混勻，再次離心并去上清液。再加入4 mL等溫的稀釋I液，混勻后吸取4 mL于另一離心管內(nèi)并封口，然后置于裝有400 mL等溫水的500 mL的燒杯中，與燒杯一起放入4 ℃的冰箱降溫。待降溫至4 ℃后，按1∶1的比例加入也已降溫至4 ℃的稀釋II液，混勻后繼續(xù)在4 ℃冰箱放置2～4 h。

1.5精液的分裝

將精液吸入已預(yù)冷至4 ℃的0.25 mL 或0.5 mL的細(xì)管中，使精液處在細(xì)管中部，細(xì)管內(nèi)精液的長(zhǎng)度約2～3 cm。

1.6冷凍與解凍

將分裝好的細(xì)管迅速放入-80 ℃超低溫冰箱中的塑料泡沫上，冷凍10 min。然后迅速放入37 ℃、45 ℃、53 ℃、61 ℃或69 ℃的水浴鍋中進(jìn)行解凍，解凍時(shí)間有5 s、8 s或11 s。

1.7存活率檢查

解凍后首先在37 ℃恒溫箱中放置5 min，然后取少量置于顯微鏡下，觀察存活精子個(gè)數(shù)，算出精子存活率。觀察時(shí)至少觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察10個(gè)精子。

1.8數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并在F值顯著情況下進(jìn)行Duncan’s多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)管規(guī)格對(duì)豬精子凍后存活率的影響

由表1可知，用0.25 mL和0.5 mL的細(xì)管冷凍保存的豬精子，其凍后存活率都較高，達(dá)0.57左右，但兩種細(xì)管之間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。

表1細(xì)管規(guī)格對(duì)豬精子凍后存活率的影響

細(xì)管規(guī)格存活率0.25mL0.57±0.027a0.5mL0.57±0.045a

注：表中上標(biāo)小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，上標(biāo)大寫(xiě)或小寫(xiě)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.2檸檬酸和甘氨酸對(duì)豬精子凍后存活率的影響

表2的結(jié)果表明，1.3%檸檬酸組凍后精子存活率極顯著高于1.7%檸檬酸組(P<0.01)，其存活率均達(dá)0.50以上，而添加甘氨酸后，無(wú)論是對(duì)1.3%檸檬酸組還是對(duì)1.7%檸檬酸組，均沒(méi)有明顯影響(P>0.05)。

表2基礎(chǔ)液配方對(duì)豬精子凍后存活率的影響

基礎(chǔ)液配方存活率1.7%CA0.45±0.035Bb1.7%CA+Gly0.42±0.027Bb1.3%CA0.51±0.022Aa1.3%CA+Gly0.52±0.027Aa

2.3甘油濃度對(duì)豬精子凍后存活率的影響

甘油濃度為3%時(shí)，凍后精子存活率最高，達(dá)0.50±0.035，顯著高于4%的甘油組(P<0.05)，極顯著高于2%的甘油組(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3甘油濃度對(duì)豬精子凍后存活率的影響

甘油濃度存活率2%0.20±0.035Bc3%0.50±0.035Aa4%0.44±0.042Ab

2.4解凍方法對(duì)豬精子凍后存活率的影響2.4.1解凍溫度對(duì)豬精子凍后存活率的影響

從表4來(lái)看，解凍時(shí)間為5 s時(shí)，體溫溫度(37 ℃)解凍后的精子存活率最低，僅為0.39±0.022，極顯著低于溫度高于體溫(包括45 ℃、53 ℃、61 ℃和69 ℃)時(shí)的凍后精子存活率(P<0.01)；在高于體溫溫度的解凍方法之間，45 ℃組和61 ℃組的凍后精子存活率極顯著高于53 ℃組和69 ℃組的凍后存活率(P<0.01)，而45 ℃和61 ℃組之間以及53 ℃和69 ℃組之間則均沒(méi)有明顯的差異(P>0.05)。5種解凍溫度中，61 ℃的凍后存活率最高，達(dá)0.61±0.055。

表4解凍溫度對(duì)豬精子凍后存活率的影響

解凍溫度存活率37℃0.39±0.022Cd45℃0.57±0.045ABab53℃0.51±0.022Bc61℃0.61±0.055Aa69℃0.53±0.045Bbc

2.4.2解凍時(shí)間對(duì)豬精子凍后存活率的影響

在解凍溫度為61 ℃的條件下，本試驗(yàn)還對(duì)解凍時(shí)間進(jìn)行了研究。表5的結(jié)果表明，解凍時(shí)間為5 s時(shí)，精子凍后存活率最高，其存活率達(dá)0.61±0.055，極顯著高于解凍時(shí)間為11 s時(shí)的凍后存活率(P<0.01)，顯著高于解凍時(shí)間為8 s時(shí)的凍后存活率(P<0.05)。解凍時(shí)間8 s和11 s之間比較，差異不顯著(P>0.05)。另外，隨著解凍時(shí)間的延長(zhǎng)，凍后豬精子的存活率有逐漸下降的趨勢(shì)。

表5解凍時(shí)間對(duì)豬精子凍后存活率的影響

解凍時(shí)間存活率5s0.61±0.055Aa8s0.54±0.042ABb11s0.49±0.042Bb

3　討論

3.1精子超低溫冰箱冷凍保存

在細(xì)管冷凍精液出現(xiàn)之前，人們?cè)酶杀鋬鼍?，也取得過(guò)不錯(cuò)的效果。干冰的溫度為-79 ℃，與-80 ℃超低溫冰箱的溫度非常接近。我們知道，許多動(dòng)物的精子在干冰上進(jìn)行過(guò)冷凍保存的研究和應(yīng)用，如牛和犬。據(jù)此推測(cè)，-80 ℃的超低溫冰箱也應(yīng)該能夠冷凍保存動(dòng)物精子。2011年，閆秀明等[8]曾將黃鱔精液裝入細(xì)管并在-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存168 h后，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)活力仍可達(dá)88%。但在家畜，還沒(méi)有見(jiàn)到在-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存精子的相關(guān)報(bào)道。從本試驗(yàn)來(lái)看，-80 ℃超低溫冰箱也可冷凍保存豬精子，且可獲得凍后存活率達(dá)0.61±0.055的效果。

3.2甘油濃度、檸檬酸和甘氨酸對(duì)豬精子凍后存活率的影響

Buhr等[9]研究發(fā)現(xiàn)，2%和4%的甘油能使豬精子的凍后活力和質(zhì)膜完整性顯著高于0%和8%的甘油。姜興剛等[10]研究表明，添加2%和4%的甘油對(duì)豬精子的冷凍保護(hù)作用顯著高于添加0%和8%甘油組，2%和4%兩個(gè)濃度之間差異不顯著。而本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在2%～4%的甘油濃度范圍內(nèi)，3%的甘油濃度凍后精子存活率最高，與Buhr等[11]和姜興剛等[10]的研究結(jié)果相近。

精液中的檸檬酸可維持pH和滲透壓的穩(wěn)定。甘氨酸則不僅能夠穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外pH和滲透壓，提高精子對(duì)冷應(yīng)激的耐受性，而且還能減少脂蛋白的代謝，緩解脂蛋白在冷凍過(guò)程中的損傷[12]。故本試驗(yàn)對(duì)稀釋液中檸檬酸和甘氨酸的作用也進(jìn)行了研究。表3的研究結(jié)果表明，檸檬酸含量能夠明顯影響凍后豬精子的存活率，1.3%的檸檬酸添加量極顯著優(yōu)于1.7%的檸檬酸添加量。而甘氨酸的添加則并未能影響豬精子的凍后存活率，這或許是由于甘氨酸添加量不適所致。

3.3解凍方法對(duì)豬精子凍后存活率的影響

Medrano A等[13]的研究表明，解凍與冷凍相似，都會(huì)使精子質(zhì)膜受到損傷。要避免精子質(zhì)膜的損傷，就需要在解凍過(guò)程中快速越過(guò)-60 ℃和-15 ℃的兩個(gè)臨界溫度區(qū)，就需要控制好解凍速率，控制好決定解凍速率的解凍溫度和解凍時(shí)間。從理論上來(lái)說(shuō)，細(xì)管的容量越大，降溫的速度就會(huì)越慢。但就0.25 mL和0.5 mL細(xì)管來(lái)講，不同的研究者所獲得的研究結(jié)果差異也很大。梁鴻斌等[14]發(fā)現(xiàn)，對(duì)0.25 mL的豬細(xì)管冷凍精液，37 ℃ 30 s的解凍效果最好。但張渭斌等[15]研究后認(rèn)為，對(duì)于0.5 mL的豬細(xì)管冷凍精液，50 ℃ 13 s的解凍要明顯好于38 ℃ 30 s的解凍。杜立銀等[16]的研究結(jié)果則表明，57 ℃ 10 s或62 ℃ 5 s的解凍，豬精液冷凍效果最佳。本試驗(yàn)結(jié)果與杜立新等的研究結(jié)果相似，61 ℃ 5 s的解凍凍后存活率最高，凍后存活率達(dá)0.61±0.055。從這些研究來(lái)看，似乎解凍速度越快，解凍后的精子存活率越高，但當(dāng)溫度達(dá)到69 ℃時(shí)，解凍后的精子存活率反而出現(xiàn)下降。

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2016-05-05

陳明明(1992-)，男，碩士研究生。

郝志明(1963-)，男，陜西綏德人，教授，碩導(dǎo)。研究方向：動(dòng)物繁殖和配子生物工程技術(shù)。

E-mail:haozhimingg@163.com

S828.3

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1005-2739(2016)05-0005-04