豆興堂，宋先忱，高　月，李萬波，王家明，張興會

(遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000)

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遼寧絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)研究

豆興堂，宋先忱，高月，李萬波，王家明，張興會

(遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000)

以遼寧絨山羊母羔為研究對象，通過超排母羔、卵母細胞體外成熟、體外受精、胚胎移植技術(shù)等試驗研究，建立了絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系。結(jié)果表明：PMSG+FHS組與FSH+PMSG組超排方法獲得的卵母細胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但PMSG+FHS組卵裂率和囊胚率均極顯著高于FSH+PMSG組(P<0.01)。成熟液添加EGF組PBⅠ率、卵裂率均顯著高于對照組(P<0.05)；20 ng/mL EGF組PBⅠ率顯著高于10 ng/mL組(P<0.05)，卵裂率差異不顯著(P>0.05)。卵母細胞成熟培養(yǎng)24～27 h組第一極體率與卵裂率均顯著高于21～24 h組(P<0.05)；SOF受精體系卵裂率顯著高于TALP(P<0.05)，囊胚率極顯著高于TALP受精系(P<0.01)。秋季胚胎移植受體母羊16只，產(chǎn)羔3只。

絨山羊；卵母細胞；體外受精；胚胎

優(yōu)良種畜高效擴繁一直是制約畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。JIVET技術(shù)近年來已成為配子與胚胎生物技術(shù)研究熱點之一，JIVET技術(shù)即幼畜胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)，集幼畜超排、活體采卵、卵母細胞體外成熟、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植等技術(shù)為一體的胚胎生物技術(shù)體系。該技術(shù)在國內(nèi)已成功應(yīng)用于小尾寒羊[1]、奶山羊[2]等。本實驗研究以4～8周齡遼寧絨山羊母羔為對象，通過母羔超排、活體采卵、體外受精與胚胎移植等技術(shù)方法，成功獲得了“試管絨山羊”，建立了絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系。

1　材料與方法

1.1實驗材料

選擇4～8周齡、體質(zhì)健壯、性情活潑、健康的遼寧絨山羊母羔。冷凍精液為實驗室自制。

1.2主要實驗設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱：HERA Cell 150，美國；立體顯微鏡：Minitube，德國；電子天平：北京賽多利斯天平公司；超純水：由Mini-Q純水儀制；電熱恒溫水浴鍋：DK-S22，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；移卵管、手術(shù)保定車：實驗室自制。

1.3主要試劑

Medium 199(with Earle’s salts)：M3769，Sigma；Mineral oil：M5904，規(guī)格：500mL，Sigma分裝；BSA：A4919，Sigma分裝；FSH：R9D19A，加拿大；寧波第二激素廠，批號：080127；LH：R8K03VB，加拿大；PMSG：1 000 IU/支，寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號：090111；肝素：H01923，Bioszune分裝；17β-雌二醇：E8875，Sigma分裝；發(fā)情羊血清(EGS)：絨山羊發(fā)情當天用常規(guī)血清制備法自制，56 ℃滅活處理30 min；其他試劑除特殊說明外均購自sigma公司。

1.4實驗方法1.4.1誘導(dǎo)母羔卵泡發(fā)育方法

母羔超排用FSH、PMSG激素，即先肌肉注射PMSG 400IU，以后每間隔12 h分別肌肉(可在頸部肌肉或后肢內(nèi)側(cè)肌肉)注射FSH 40 mg 3次。

1.4.2卵母細胞活體采集

母羔在最后一次超排注射后12～16 h，手術(shù)活體采集卵母細胞。母羔保定于手術(shù)車上，常規(guī)手術(shù)打開腹腔，將一側(cè)卵巢牽引至切口外，固定。10 mL注射器抽取2～3 mL采卵液，先逐一刺破卵巢表面卵泡抽取卵泡液和COCs，直至表面卵泡全部采集完。然后手觸碰卵巢內(nèi)卵泡，采集卵巢內(nèi)部卵母細胞，直至觸碰不到卵泡，卵巢恢復(fù)原形。采集時間應(yīng)越短越好，控制在10 min左右。注意注射器內(nèi)采卵液溫度應(yīng)保持30 ℃以上。抽取力量不應(yīng)過大，避免卵丘顆粒細胞脫落形成裸卵。采卵液：TCM-HCO3+10 μg/mL Heparin+5%EGS+2.2 mg/mLNa-pyrunate+2.383mg/mL HEPES+2.603 mg/mL HEPES-Na+10 μL/mL青鏈霉素。

1.4.3卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

用四孔板培養(yǎng)體系。在38.5 ℃、40×體視顯微鏡下，迅速撿取卵母細胞轉(zhuǎn)移到洗滌液中，并將COCs進行分級(A級：卵丘細胞3層以上，胞質(zhì)均勻；B級：1～2層卵丘細胞，胞質(zhì)均勻；C級：卵丘細胞不完整、裸卵或退化的卵母細胞)，A、B級卵母細胞洗滌2～3遍，轉(zhuǎn)移到四孔板成熟培養(yǎng)液(每孔600 μL成熟液、上覆礦物油，預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱中平衡4h)中，每孔25～30枚卵母細胞，38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度下成熟培養(yǎng)24 h以上。卵母細胞成熟培養(yǎng)液為：TCM-HCO3+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL E2+10%EGS+2.2mg/mL Na-pyrunate+0.012mg/mL cystein-e+10 μL/mL青鏈霉素。

1.4.4體外受精

取解凍后的精液150～200 μL，輕輕加入到含有800 μL獲能液的圓底玻璃試管(預(yù)先38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度下平衡4 h)的底部，豎直輕輕放入CO2培養(yǎng)箱，使精子獲能上游20～30 min，受精備用。將成熟培養(yǎng)后的卵母細胞轉(zhuǎn)移到受精液中，受精液洗滌2～3遍；將卵母細胞轉(zhuǎn)移到含受精液的四孔板(每孔400 μL受精液，上覆礦物油，預(yù)先38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度下平衡4h)中，每孔25～30枚卵母細胞。取微量圓底玻璃試管中的上清液，顯微鏡下檢查精子活力，判定精子合格后，受精。根據(jù)精子密度取100～150 μL上清液，輕輕加入到有卵母細胞的四孔板中，避免產(chǎn)生氣泡。四孔板放入CO2培養(yǎng)箱，38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度下精卵受精作用22～24 h。精子獲能液：SOF(或TALP)基礎(chǔ)液+10%EGS+25 μg/mL肝素+10 μL/mL青鏈霉素。受精液：SOF(或TALP)基礎(chǔ)液+6 mg/mL BSA+1 μg/mL亞牛磺酸鈉+10 μL/mL青鏈霉素。

1.4.5早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

精卵受精作用22～24 h后，將假定合子轉(zhuǎn)移到胚胎發(fā)育洗滌液中，巴氏撿卵管輕輕吹打假定合子周圍的卵丘細胞與粘附的精子，使之脫落。體視鏡下配合撿卵管撥動假定合子，觀察PBⅡ。將假定合子在胚胎發(fā)育液中洗滌2～3遍，轉(zhuǎn)移到含胚胎發(fā)育液的四孔板(每孔600 μL發(fā)育液，上覆礦物油，預(yù)先38.5 ℃、5%CO2、飽和濕度下平衡4 h)中，38.5 ℃、5%CO2、5%O2、90%N2發(fā)育培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h觀察卵裂情況，并統(tǒng)計卵裂率，挑出單細胞，卵裂胚胎繼續(xù)發(fā)育培養(yǎng)。卵裂胚胎用添加BSA的SOF培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，再換液用添加FBS的SOF液培養(yǎng)至囊胚，培養(yǎng)中每24 h半量置換培養(yǎng)液。

1.5統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析，差異顯著性用one-way ANOVA檢驗，P>0.05認為差異不顯著，P<0.05認為具有顯著性差異，P<0.01認為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1不同超排方法對超排效果、體外受精卵裂率和囊胚率的影響

表1不同超排方法對超排效果、卵裂及胚胎發(fā)育的影響

組別羔羊/只卵泡/個平均卵數(shù)/個卵裂率/%囊胚率/%PMSG+FSH636661.00±13.93a42.43(143/337)A47.59(69/145)AFSH+PMSG651585.83±18.35a22.80(101/443)B25.74(26/101)B

從表1可以看出，兩種超排方法獲得的平均卵母細胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但PMSG+FHS組卵裂率和囊胚率均極顯著高于FSH+PMSG組(P<0.01)。表明超排方法不僅影響超排效果且對體外受精后卵裂及胚胎發(fā)育有很大影響。

圖1　母羔超排卵巢

圖2　成熟卵母細胞100×

圖3　成熟卵母細胞(PbⅠ)400×

2.2成熟液添加EGF對卵母細胞成熟與卵裂的影響

表2成熟液添加EGF對卵母細胞成熟與卵裂的影響

EGF濃度(ng/mL)卵母細胞/枚PbⅠ率/%卵裂率/%06952.17(36/69)a25.00(9/36)a108160.49(49/81)b34.69(17/49)b209871.43(70/98)c38.57(27/70)b

表2表明，成熟液添加EGF對卵母細胞成熟與卵裂有很大影響。添加EGF組PBⅠ率、卵裂率均顯著高于對照組(P<0.05)；20 ng/mL EGF組PBⅠ率顯著高于10 ng/mL組(P<0.05)，卵裂率差異不顯著(P>0.05)。

2.3卵母細胞IVM時間對成熟及卵裂的影響

表3卵母細胞IVM時間對成熟及卵裂的影響

IVM時間/h卵母細胞/個PbⅠ率/%卵裂率/%21～245856.89(33/58)a24.24(8/33)a24～277268.06(49/72)b40.82(20/49)b27～304971.43(35/49)b34.29(12/35)b

從表3可以看出，卵母細胞成熟培養(yǎng)24～27 h組PbⅠ率顯著高于21～24 h組(P<0.05)，與27～30 h組差異不顯著(P>0.05)；卵裂率方面，卵母細胞成熟培養(yǎng)24～27 h組卵裂率顯著高于21～24 h組(P<0.05)，與27～30 h組差異不顯著(P>0.05)。

圖4　受精(PbⅡ)

圖5　早期囊胚

圖6　出生的羔羊

2.4不同受精體系對卵裂及胚胎發(fā)育能力的影響

從表4可以看出，SOF受精體系卵裂率顯著高于TALP(P<0.05)，囊胚率極顯著高于TALP受精系(P<0.01)。

表4受精體系對胚胎發(fā)育的影響

受精體系卵母細胞/個卵裂率/%囊胚率/%TALP7826.92(21/78)a19.05(4/21)ASOF8340.96(34/83)b41.18(14/34)B

2.5母羔體外胚胎移植情況

2011年11月通過超排母羔、采集卵母細胞、體外受精，生產(chǎn)母羔體外胚胎，2～4細胞期體外胚胎移植受體母羊16只，2012年4月開始3只受體母羊產(chǎn)羔3只，其中難產(chǎn)死亡1只，體外胚胎移植產(chǎn)羔率為18.75%。

3　討論

3.1超排方法不僅影響超排效果且對體外受精后卵裂及胚胎發(fā)育有很大影響。目前幼羔超排方法以FSH+PMSG聯(lián)合使用較多[1～3]。本試驗比較了FSH+PMSG和PMSG+FSH超排方法，結(jié)果表明兩種超排方法超排效果沒有差異，但PMSG+FSH法對體外受精卵裂和胚胎發(fā)育有較大促進作用?？赡芘cPMSG作用時間稍長，能促進卵泡卵母細胞充分生長發(fā)育有關(guān)。PMSG是糖蛋白激素中唯一獨特的促性腺激素，同一分子中具有黃體生成素和促卵泡生成素兩種促性腺激素的活性，由于PMSG在動物體內(nèi)的半衰期較長，同一分子又具有FSH和LH的雙重活性，在動物體內(nèi)，其生理作用是對卵巢和睪丸的靶細胞受體，特異性極強。

3.2表皮生長因子(EGF)是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個氨基組成的活細胞，藉由刺激表皮細胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，其最大特點是能夠促進細胞的增殖分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡的細胞。王艾平[4]等在卵母細胞成熟液中添加EGF，結(jié)果含50 ng/mL EGF組COCs成熟率 (75.45%～75.8%)和卵裂率 (72.4%～74.1%)均顯著高于其它組。表明EGF對COCs體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進作用。劉丑生[5]等在綿羊卵母細胞成熟液中添加EGF，結(jié)果為50 ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對照組和10、20、30、40 ng/mL組(P<0.05)。本試驗結(jié)果表明，EGF對卵母細胞成熟、體外受精卵裂有很大促進作用。

3.3卵母細胞IVM時間對其成熟及體外受精都有很大影響。張勇等[6]認為，成熟培養(yǎng)20 h，24 h的卵母細胞成熟率顯著高于培養(yǎng)16 h，核成熟后培養(yǎng)3～4 h有利于卵母細胞質(zhì)成熟，對其后的受精、卵裂及胚胎的進一步發(fā)育有重大影響。本實驗結(jié)果表明，卵母細胞成熟培養(yǎng)24～27 h組成熟率、卵裂率均顯著高于21～24 h組，27～30 h組成熟率(71.43%)高于24～27 h組(68.06%)，差異不顯著；24～27 h組卵裂率(40.82%)高于27～30 h組(34.29%)，差異不顯著。劉澤隆[7]研究表明，山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)18～24 h，15～25 h，成熟率逐漸提高，而在30～35 h時則退化程度嚴重。但母羔卵母細胞體外成熟可能需要稍長的時間，具體成熟時間對卵裂及胚胎發(fā)育的影響，值得進一步試驗研究。

3.4受精培養(yǎng)液對卵母細胞受精和卵裂有很多影響。國外較多采用TALP液研究性成熟前山羊卵母細胞的體外受精，用添加了50 μg/mL肝素的mDM液獲能，用添加1 μg/mL亞牛磺酸的TALP液受精[8]。張鎖鏈[9]等采集種公羊新鮮精液，以0.5 μM A-23187處理1min或在培養(yǎng)液中添加50 μg/mL肝素獲能，用2 mM咖啡因、20 μg/mL BSA的BO液做受精液，2～4細胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。趙宏遠[2]采集超排母山羊羔卵母細胞，成熟培養(yǎng)后用SOF液受精，受精培養(yǎng)23～26 h組，平均卵裂率為48.33%。武建朝[10]研究結(jié)果表明，TALP受精液(卵裂率42.11%)比BO更適合母羔體外受精及卵裂。本試驗結(jié)果顯示，SOF受精體系更適合絨山羊母羔卵母細胞體外受精。

3.5羔羊體外生產(chǎn)胚胎在母體子宮內(nèi)附植后的發(fā)育力弱，產(chǎn)羔率低，是羔羊體外胚胎移植存在的主要問題。可能與幼羔卵母細胞成熟程度有很大關(guān)系，尤其在與成年羊卵母細胞在卵母細胞直徑、能量、蛋白合成、胞質(zhì)成熟和分子生物學的差異[11]，也可能是妊娠過程中由于流產(chǎn)和木乃伊影響了正常胎兒的發(fā)育，胚胎發(fā)育失敗和附植前后胚胎丟失等等?？傊?，羔羊體外胚胎移植產(chǎn)羔受很多因素影響，效果不穩(wěn)定。提高羔羊卵母細胞的體外胚胎生產(chǎn)效率和移植妊娠率，是今后應(yīng)著力研究解決的問題。

[1]陳曉勇，田樹軍，桑潤滋，等.誘導(dǎo)幼羔卵泡發(fā)育及體外胚胎生產(chǎn)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2008，(16)3：456-460.

[2]趙宏遠.影響山羊幼羔卵泡發(fā)育及體外受精效果主要因素研究[D]：[碩士學位論文].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，2009.

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Study on Technology of Embryo ProductioninvitroLiaoning Cashmere lamb

DOU Xing-tang，SONG Xian-chen，GAO Yue，LI Wang-bo，WANG Jia-ming，ZHANG Xing-hui

(Institute of Animal Husbandry Science of Liaoning Province，Liaoyang 111000，China)

This dissertation taked the Liaoning Cashmere Goat female lambs as the research object.it has been created that in vitro embryo producton system of Liaoning Cashmere goat female lambs by studied on superovulation，IVM，IVF，ET.The results were showed that the number of oocytes collected by PMSG+FHS and FSH+PMSG superovulation was no significant difference，but Cleavage rate and blastula rate of PMSG+FHS group were both very significant higher than that of FSH+PMSG group(P<0.01)；Secondly，PBⅠrate and cleavage rate of oocytes maturation culture solution with EGF were both significant higher than that of control group (P<0.05)，PBⅠrate of culture solution with 20ng/mL EGF group was significant higher than 10ng/mL group (P<0.05)，but cleavage rate was no significant difference (P>0.05).PBⅠrate and cleavage rate of oocytes maturation 24-27h group were both significant higher than that of 21-24h group (P<0.05)；Cleavage rate of SOF IVF system was significant higher than that of TALP(P<0.05)，blastula rate of SOF IVF system was very significant higher than that of TALP(P<0.01).And then，in autumn in vitro embryos of Liaoning Cashmere goat female lambs were transferred to oviduct of 16 recipient of female Liaoning Cashmere goat，3 lambs were born next year.

Cashmere goat；Oocyte；In vitro fertilization；Embryo

2016-06-29

豆興堂(1978-)，男，農(nóng)業(yè)推廣碩士，高級畜牧師。

E-mail:dou791120@sina.com

S826.3

A

1005-2739(2016)05-0009-05