李祥平

（1.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津　300301；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津　300301）

卵黃和十二烷基硫酸鈉添加量對犬精子凍后活率的影響

李祥平1，2

（1.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津300301；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津300301）

本試驗以Trjs-葡萄糖稀釋液為基礎(chǔ)稀釋液，就卵黃（20%、25%、30%）和十二烷基硫酸鈉（SDS）的添加量（0.725 mg/ml、1.000 mg/ml、1.500 mg/ml）對犬精子凍后活率的影響進行了研究。試驗結(jié)果表明，（1）20%的卵黃添加量組犬精子的凍后活率最高。25%卵黃添加量組和30%卵黃添加量組比較則沒有明顯差異（F＜F0.05）。（2）添加SDS與對照組比較，添加SDS組的精子凍后活率都較高。三種SDS添加量中，1.000 mg/ml的添加量效果最好，凍后精子活率極顯著（F＞F0.01）或顯著（F＞F0.05）高于添加量為0.725 mg/ml和1.500 mg/ml時的凍后精子活率。

犬精子；冷凍；卵黃；十二烷基硫酸鈉

1 材料和方法

1.1實驗動物

雄性德國牧羊犬一只，6歲，體況中等，身體健康，精液品質(zhì)較好。

1.2實驗器械和試劑

1.2.1實驗器械

集精杯、恒溫恒濕、培養(yǎng)箱、離心機、顯微鏡、電子天平、細管精液冷凍儀。

1.2.2實驗試劑

Tris、檸檬酸、葡萄糖、丙三醇、十二烷基硫酸鈉、卵黃

1.2.3稀釋液配方

（1）基礎(chǔ)稀釋液（Tris-葡萄糖稀釋液）

Tris 3.04%，檸檬酸1.7%，葡萄糖1.25%，雙蒸水配置。

（2）稀釋Ⅰ液（V/V）

試驗一：80%基礎(chǔ)稀釋液 + 20%卵黃；

75%基礎(chǔ)稀釋液 + 25%卵黃；

70%基礎(chǔ)稀釋液 + 30%卵黃。

試驗二：80%基礎(chǔ)稀釋液 + 20%卵黃；

80%基礎(chǔ)稀釋液 + 1.45mg/ml SDS + 20%卵黃；

80%基礎(chǔ)稀釋液 + 2mg/ml SDS + 20%卵黃；

80%基礎(chǔ)稀釋液 + 3mg/ml SDS + 20%卵黃；

（3）稀釋Ⅱ液（V/V）

90%稀釋Ⅰ液+10%甘油。

1.3實驗方法

1.3.1公犬保定

雙腿夾住頸部保定。

1.3.2人工按摩采精

采精者左手握住陰莖向后推包皮使球體露出，反復(fù)按摩球體。當(dāng)犬的尾部和后肢出現(xiàn)擺動時，右手握住集精杯準備接精，收集精液的中間部分。

1.3.3鮮精品質(zhì)評定

采出的精液要檢查色澤、氣味、射精量、精子活力和密度等。

1.3.4鮮精的處理、降溫及平衡

將鮮精裝入塑料試管中，用記號筆標注精液的體積，以1500rpm離心5min，棄掉上清液，加入基礎(chǔ)稀釋液至試管標線處，混合后以同樣的方法進行二次離心，棄上清液，加入適量的與鮮精等溫的稀釋Ⅰ液進行稀釋并混勻。棉塞封口，放入盛有400ml30℃熱水的500ml燒杯中，4℃冰箱中降溫。18h后，將等體積的已預(yù)冷至4℃的稀釋Ⅱ液緩慢加入精液中，混勻后放回4℃冰箱，平衡4h。

1.3.5凍前準備和冷凍

（1）凍前準備

（1）凍前檢查精子活率，并記錄。

（2）測量液氮面高度。

（3）細管冷凍插座預(yù)冷：使溫度降為-70℃。

（4）裝管。

（2）冷凍

將裝有精液的細管插入已預(yù)冷的細管冷凍插座內(nèi)，立即放入液氮罐內(nèi)液面上方要求的高度進行熏蒸，10min后提出細管冷凍插座，取出細管，立即放入冷凍提筒內(nèi)投入液氮。

（3）解凍和凍后精子活率的檢查

從液氮中取出細管，放入70℃的水中7秒進行解凍。解凍后在400倍鏡下進行精子活率判定。

1.4實驗結(jié)果統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)按單因子試驗進行統(tǒng)計分析，并按F檢驗進行顯著性檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1卵黃添加量對犬精子凍后活率的影響

表1　卵黃添加量對犬精子凍后活率的影響

從表 1 看，三種卵黃添加量組中，20%的卵黃添加量組犬精子的凍后活率最高，極顯著優(yōu)于25%卵黃添加量組和30%卵黃添加量組（F>F0.01）。25%卵黃添加量組和30%卵黃添加量組比較則沒有明顯差異（F＜F0.05）。

2.2十二烷基硫酸鈉添加量對犬精子凍后活率的影響

表2　十二烷基硫酸鈉（SDS）添加量對犬精子凍后活率的影響

從表 2 試驗結(jié)果來看，與對照組比較，添加SDS組的精子凍后活率都較高。其中，SDS添加量為1.000 mg/ml和1.500 mg/ml時，凍后精子活率極顯著（F>F0.01）或顯著（F> F0.05）高于對照組。

3 討論

3.1卵黃對犬精子凍后活率的影響

卵黃能維持稀釋液的膠體滲透壓，保護精子質(zhì)膜和頂體膜免遭陽離子肽損害［1］［2］。為了提高犬精子的凍后活率，我們對卵黃添加量進行了進一步研究。從表1試驗結(jié)果來看，卵黃添加量以20%為最好，凍后活率明顯好于卵黃添加量為25%和30%時的凍后活率。這與大多數(shù)研究報道和生產(chǎn)實踐中常用20%的卵黃添加量相吻合。為什么增加卵黃添加量精子的凍后活率反而出現(xiàn)下降，可能因為卵黃添加增加使稀釋液中其它成分的濃度降低所致。

3.2SDS對犬精子凍后活率的影響

1972年Graham等人［3］首先報道了在精子稀釋液中添加Orvus ESPaste（氨基-鈉-十二烷基硫酸脂，OEP）可以減少凍融過程對精子的損傷。

由于OEP含有SDS，所以本試驗直接選用SDS就其對犬精子凍后活率的影響進行了研究。從表2試驗結(jié)果來看，精液稀釋液中添加SDS確實能夠提高凍后犬精子的活率。

4 結(jié)論

（1）三種卵黃添加量中，20%的卵黃添加量冷凍效果最好，凍后精子活率極顯著高于卵黃添加量為25%和30%時的凍后精子活率。

（2）SDS添加量為1.000 mg/ml和1.500 mg/ml時，凍后精子活率極顯著（F>F0.01）或顯著（F>F0.05）提高。三種SDS添加量中，1.000 mg/ml的添加量效果最好。

［1］Cardoso RDS etal Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerol concentrations［J］.Therio -genology，2003，59（3-4）：743-751.

［2］潘壽文，劉湖，馬大君.犬的精液冷凍技術(shù).畜牧與獸醫(yī)［J］，1986 （3）：105-106.

［3］Graham C D，Graham E F.Some factors influencing the freezing of boar spermatozoa［M］.In：Proceeding of theSeventh International Congress on Animal Reproduction.MunichⅡ，1972：1627-1632.