徐婷婷 劉運(yùn)鎮(zhèn) 紀(jì)康 趙莎莎

摘要：以新西蘭兔精液為研究對(duì)象，對(duì)新鮮精液采用不同的靜置時(shí)間、離心速度、離心時(shí)間及精清留量進(jìn)行處理，經(jīng)過超低溫保存后，通過測(cè)定精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性來選擇兔精液冷凍保存最近佳預(yù)處理方案。結(jié)果表明，精液離心前靜置60～90 min再以 1 000 r/min的速度離心，其凍后活率及復(fù)蘇率明顯優(yōu)于其他靜置時(shí)間；離心 10 min 時(shí)的效果優(yōu)于其他離心時(shí)間；采用1 000 r/min的速度離心時(shí)，相同離心時(shí)間均較其他離心速率冷凍-解凍后精液活率、復(fù)蘇率、精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性高；離心后，精清留量和精液的體積比為1 ∶[G-3]1的凍后活率、復(fù)蘇率、精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性優(yōu)于精液與精清的體積比為0 ∶[G-3]1、2 ∶[G-3]1。

關(guān)鍵詞：兔；精液保存；活率；頂體；完整性；質(zhì)膜；精清留量

中圖分類號(hào)：S82913+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0243-02

精液超低溫冷凍保存，對(duì)動(dòng)物種質(zhì)資源保護(hù)有重要作用。精液冷凍保存在牛、豬上都有比較成熟的技術(shù)方案，在生產(chǎn)實(shí)踐上應(yīng)用較廣泛。但迄今為止，關(guān)于兔精液的冷凍保存研究相對(duì)較少，尚未形成完整的技術(shù)方案和技術(shù)突破。由于夏季氣溫較高，兔的受孕率不論是自然受孕還是人工授精都比春秋季大幅降低，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了較大的影響，因此研究兔精液超低溫保存、形成完整的技術(shù)準(zhǔn)則成為當(dāng)前最迫切的研究任務(wù)。

1材料與方法

11材料

111儀器設(shè)備

電子天平、熒光倒置顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥箱、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、液氮生物容器、冰箱、蒸汽滅菌器、雙人單面凈化工作臺(tái)、超聲波清洗儀、加熱板、025 mL細(xì)管等。

112試劑

NaCl、Cl、Na2HPO4·12H2O、H2PO4、CaCl2、MgCl2、無水葡萄糖、二水檸檬酸鈉、青霉素鉀、硫酸鏈霉素、檸檬酸、甘氨酸、甘油、牛血清白蛋白、Tris。

113試驗(yàn)動(dòng)物

江蘇鹽城正山兔業(yè)有限公司的1～2歲優(yōu)質(zhì)新西蘭種公兔，體質(zhì)健康，無繁殖疾病。試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度24 ℃左右，濕度50%左右，每天光照12 h，定量喂食全價(jià)配合飼料，自由飲水。

12方法

121溶液的配制

PBS液（磷酸鹽緩沖液的配制： NaCl 08 g，Cl 002 g，CaCl2 0013 2 g，Na2HPO4·12H2O 0289 8 g，H2PO4 002 g，MgCl2·6H2O 0012 1 g，加雙蒸水至100 mL，pH值調(diào)至72，022 μm濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BTS液（常溫保存液的配制：葡萄搪37 g，二水檸檬酸三鈉06 g，乙二胺四乙酸二鈉0125 g，NaHCO3 0125 g，Cl 0007 5 g，青霉素鈉006 g，硫酸鏈霉素01 g，加雙蒸水至100 mL，pH值調(diào)至72，022 μm濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

冷凍稀釋液的配制：葡萄糖159 g，檸檬酸196 g，Tirs 352 g，青霉素鈉006 g，硫酸鏈霉素01 g，甘油4%，卵黃20%，加雙蒸水至100 mL，pH值調(diào)至621，022 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

解凍液的配制：葡萄糖50 g，檸檬酸鈉05 g，10%安鈉咖5 mL，青霉素8萬IU，硫酸鏈霉素10萬IU，加雙蒸水至100 mL，022 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PI染色溶液的配制： PI 005 g溶解于20 mL PBS液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DABCO防熒光淬滅劑的配制：甘油/PBS（9 ∶[G-3]110 mL、DABCO 0024 6 g，1 mL分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

122精液采集

在采精器中注入溫水并裝上預(yù)熱至35～37 ℃的集精管，將發(fā)情成年母兔放入公兔籠內(nèi)，誘導(dǎo)公兔爬跨母兔，將陰莖導(dǎo)入母兔陰門處的采精器內(nèi)，公兔射精后側(cè)倒時(shí)迅速將采精器豎立拿出兔籠，棄去夾層中的溫水，使精液全部流入集精管中。于 37 ℃下進(jìn)行精液常規(guī)質(zhì)量檢查，選擇無異味、乳白色、精子形態(tài)正常、活率在07以上、密度適中的精液用于試驗(yàn)。精子活率的檢測(cè)方法：20 μL精液充入37 ℃預(yù)熱的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下觀察向前運(yùn)動(dòng)精子所占的比值即為精子活率。

123精液的預(yù)處理

1231離心前靜置時(shí)間將采集的合格精液保存在37℃的保溫瓶中，分別靜置15、30、60、90 min。

1232離心速率分別以500、1 000、1 500、2 000 r/min的速度分別離心5、10、15 min。

1233精清留存量將離心后的精液分別按照精清與精子的體積比為0 ∶[G-3]1、1 ∶[G-3]1和1 ∶[G-3]2的量留取，然后用等溫稀釋液進(jìn)行稀釋。

1234稀釋與平衡將符合要求并且經(jīng)過預(yù)處理的精液按1 ∶[G-3]2的體積比與等溫的稀釋液混合，搖勻，放入5 ℃冰箱中平衡2 h。

1235冷凍精液的制備與解凍采用025 mL細(xì)管法進(jìn)行冷凍，將裝有精液的細(xì)管置于充分預(yù)冷廣口冷凍容器內(nèi)的管架上，距離液氮面3 cm，熏蒸10 min，然后投入液氮罐提桶內(nèi)保存。解凍時(shí)，將細(xì)管取出后直接投入37 ℃溫水中解凍45 s，用等溫解凍液按體積比為1 ∶[G-3]10稀釋，37℃水浴10 min。

1236精液品質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)及方法（1精子活率。取 10 μL 精液PI熒光染色法進(jìn)行判斷（死精子PI染色后呈陽(yáng)性，活精子PI染色后呈陰性，置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在 400×顯微鏡下評(píng)定精子活率。每次至少檢查 200 個(gè)精子。計(jì)算公式：活率=未著色精子數(shù)/總精子數(shù)。（2質(zhì)膜完整率。將解凍后的精液用果糖-檸檬酸鈉低滲液（0675 6 g 果糖、0367 6 g二水檸檬酸鈉溶于50 mL雙蒸水中稀釋，調(diào)整精子密度為 100萬～200萬spz/mL，37 ℃孵育 30 min，取 20 μL 精子懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，400×倒置顯微鏡觀察，每次至少計(jì)數(shù) 200 個(gè)精子，計(jì)算彎尾精子的比率，計(jì)算公式：質(zhì)膜完整率=彎尾精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。（3精子頂體完整率。采用姬姆薩染色法測(cè)定，計(jì)算公式：精子頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

13數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有處理均至少重復(fù)5次，每次計(jì)數(shù)精子數(shù)不少于200個(gè)。采用t檢驗(yàn)和方差分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<005為差異顯著。

2結(jié)果與分析

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在稀釋前將精液靜置60～90 min可有效地使精子和精清接觸，精子獲得了對(duì)冷休克及冷凍損傷更強(qiáng)的抵抗力，靜置時(shí)間太長(zhǎng)可引起精清變質(zhì)，從而對(duì)精子質(zhì)量產(chǎn)生影響。同時(shí)，精子不運(yùn)動(dòng)也容易形成假死狀態(tài)，靜置時(shí)間過短，精子不能和精清充分接觸，對(duì)冷休克和冷損失的抵抗能力較差。

以1 000 r/min的離心速度離心10 min，解凍后活率、復(fù)蘇率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達(dá)到038、5429%、5326%、7438%。不離心或者離心速率太小、時(shí)間太短，精液體積過大稀釋效果不佳，而如果離心速度過快、時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)使精子在離心管底部凝結(jié)，從而導(dǎo)致形態(tài)異常，活率下降。endprint