王海濤　許靖　張舒　肖中　蔡峰　范艷紅　李挺　生淑紅　付佑輝　池峰　周晨

(上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院呼吸內科， 上海 200137)

?

·論著·

中國漢族人群COPD吸煙史患者HHIP基因多態(tài)性與肺癌的相關性研究*

王海濤許靖張舒肖中蔡峰范艷紅李挺生淑紅付佑輝池峰周晨

(上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院呼吸內科， 上海 200137)

目的探討中國漢族人群COPD吸煙史患者HHIP基因多態(tài)性與發(fā)生肺癌風險的相關性。方法以672例COPD患者作為研究對象，依據(jù)病情分為試驗組(COPD合并肺癌患者，n=265)和觀察組(單純COPD患者，n=207)，采用連接酶檢測反應法對患者HHIP基因的多態(tài)性位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420進行多態(tài)性分析。對連鎖不平衡性分析及SNP點基因型與肺癌風險進行Logistic回歸分析。結果HHIP基因位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420經(jīng)Hardy·Weinberg平衡檢驗，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。以是否合并肺癌為因變量，各研究位點基因型多態(tài)性為自變量，行Logistic回歸分析(年齡、性別、吸煙狀況進行校正)，結果顯示，HHIP基因位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420與COPD患者是否并發(fā)肺癌無統(tǒng)計學關系(P>0.05)。結論本研究未發(fā)現(xiàn)HHIP基因的6個多態(tài)性位點與中國漢族COPD患者的肺癌發(fā)病風險有明確相關性。

COPD；HHIP；基因多態(tài)性分析；肺癌；LDR

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺癌是吸煙患者所導致的呼吸道最常見疾病，研究表明：吸煙所產(chǎn)生的尼古丁等有害物質及患者的基因易感性是導致這兩種疾病在吸煙人群中高發(fā)的重要原因。近年來有研究表明：伴有吸煙史的COPD患者中有高比例患者會發(fā)生肺癌：有50%～90%的肺癌患者都有明確的COPD病史，有約40%～77%的COPD患者及15%～25%的肺癌患者有遺傳傾向[1-2]。有學者認為：伴有吸煙史的部分COPD患者及肺癌患者可能存在共同的病理過程和易感基因。且有研究報道人認為HHIP(human hedegehoginteratting protein,HHIP)基因多態(tài)性與COPD患者發(fā)生肺癌相關[3-5]。但目前研究報道對象均為歐美人群，無亞洲人群和中國人群的研究報告，而國外所報道的研究結果是否符合亞洲及中國人群的基因特點目前仍不清楚。因此本研究以中國漢族COPD及COPD合并肺癌患者為主要研究對象，對HHIP基因的多態(tài)性位點進行檢測，旨在從分子水平上探索HHIP基因多態(tài)性與漢族COPD患者發(fā)生肺癌風險之間的關系，現(xiàn)將結果匯報如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年1 月至2015年7月期間在上海市第七人民醫(yī)院呼吸內科及腫瘤科住院治療的慢性阻塞性肺疾病患者672例作為研究資料，所有患者均有明確的吸煙史，吸煙史以包×年為單位，其中男性529例，女性143例，年齡54～70歲，均為漢族，彼此無親緣關系，依據(jù)病情分為兩組，465例COPD合并肺癌患者(試驗組)和207例單側COPD患者(觀察組)，見表1。

表1　兩組患者一般情況比較

1.2方法

1.2.1患者DNA的提取所有患者均在入院即刻抽取外周血靜脈5mL，采用枸櫞酸管抗凝保存，選取全血基因組DNA提取試劑盒(美國Promega試劑盒)，參照試劑盒說明書，對全血基因組DNA進行提取，之后立即于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計于http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/(國際人類基因組單倍圖計劃)網(wǎng)站，參數(shù)設置：r2>0.8，MAF>0.05，目標人群為中國人群；為了反映整個基因的信息，我們選擇了該基因的所有的6個標簽SNPs：rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420，查閱相關文獻選擇設計HHIP基因引物[6-10]，并交由上海瀚宇生物工程有限公司最后合成，具體序列見表2。

1.2.3連接酶檢測反應法分析HHIP基因多態(tài)性其中DNA模板1 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl0.6 μL，dNTP 2 μL，上下游引物混合2 μL，Taq酶0.2 μL，補水至20 μL。擴增條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；65 ℃ 3 min。連接反應：PCR產(chǎn)物4 μL，10×Taq DNA、Ligase Buffer 1 μL，TaqDNA Ligase(2 U/μL)0.05 μL，探針(2P)1 μL/條，補H2O至10 μL。連接條件：94 ℃ 15 s，50 ℃ 25 s，40個循環(huán)。取1 μL延伸產(chǎn)物，加8 μL Loading Buffer，94 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。

表2　相關SNP位點的引物序列

2　結果

2.1連鎖不平衡性分析本研究中的HHIP基因位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420經(jīng)Hardy·Weinberg平衡檢驗，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性，見表3。

表3　兩組患者SNP位點的連鎖不平衡性分析結果

2.2SNP點基因型與肺癌風險Logistic回歸以是否合并肺癌為因變量，各研究位點基因型多態(tài)性為自變量，行Logistic回歸分析(年齡、性別、吸煙狀況進行校正)，結果顯示，HHIP基因位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420與COPD患者是否并發(fā)肺癌無統(tǒng)計學關系(P>0.05)，見表4。

表4各SNP點基因型與肺癌風險Logistic回歸分析結果

Table 4Logistic regression analysis of SNP genotype and lung cancer risk

SNP位點基因型觀察組(n=465)對照組(n=207)P矯正前矯正后矯正OR值(95%CI)rs1489758AA2041010.6110.5721AC170511.162(0.87～1.352)CC90541.207(0.724～1.578)rs1489759CC1971150.5940.5531CT182551.148(0.889～1.425)TT86371.117(0.751～1.766)rs10519717CC2171210.4891CT155520.4111.368(0.953～1.507)TT93341.462(0.751～1.690)rs13131837CC1891030.1610.1561CT177601.962(0.766～1.209)TT99340.700(0.486～1.009)rs1492820AA2051070.5590.4181AG174521.159(0.925～1.453)GG86481.120(0.751～1.671)rs7689420CC1991090.5450.4651CT181611.126(0.899～1.412)TT85371.113(0.746～1.661)

3　討論

COPD合并肺癌是近年的研究熱點，通過對年輕人、健康吸煙者與COPD和肺癌高危人群的研究，或許可以進一步揭示COPD與肺癌的復雜分子生物學關系，發(fā)現(xiàn)早期癌變過程中新的分子生物學標志物，從分子和細胞水平篩查出有支氣管癌前病變的高危人群及肺癌患者[10-11]。為肺癌的甲期診斷和治療提供手段，甚至實現(xiàn)肺癌的預防，在伴有吸煙史的肺癌及COPD患者中所進行的全基因組關聯(lián)研究(GWAs)結果表明：在所發(fā)現(xiàn)有意義的染色體位點中，15q25、4q31及6q31在這2種疾病中出現(xiàn)重疊[12-13]。因此對于吸煙患者，這些重疊染色體位點所編碼的基因則可能成為這2種疾病的共同易感基因。4q31染色體位點編碼的HHIP基因是Hedgehog(Hh)信號通路的關鍵調解因子. Hh信號通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅胚胎中，在多種組織中均有表達，參與組織的發(fā)生、修復和異常增生，Hh信號通路激活的同時，可通過Hh蛋白激活HHIP基因的表達，HHIP蛋白與Hh信號通路中的3個Hh蛋白(即Shh、Dhh、Ihh)相結合使其失活，從而反饋抑制Hh信號通路的活性[14-15]。

對于吸煙的COPD患者，煙草產(chǎn)生的尼古丁等有害物質可破壞呼吸道上皮的完整性。生理情況下，Hh信號通路的再激活可能與氣道上皮對尼古丁等有害物質產(chǎn)生的刺激應答有關，呼吸道上皮受到損傷后，其組織內Hh信號通路被再激活，通過調控干細胞及祖細胞的增殖分化，進一步誘導再生的遠端肺間質細胞分化為平滑肌細胞，從而促進組織修復[16-17]。然而，再激活的Hh信號通路需要通過HHIP基因的負反饋抑制而正常下調，其負反饋機制一旦出現(xiàn)異常，則會失去對上述分化過程的正確調控，導致上皮細胞生長分化缺陷。Madison等的研究發(fā)現(xiàn)：HHIP基因表達異常的胎兒期小鼠，其小腸上皮表現(xiàn)出異常的泛平滑肌化；如果類似的變化出現(xiàn)于小氣道，就可能影響氣道平滑肌層的厚度，引起肺組織結構塌陷，從而在一定程度上導致氣流受限[18]。

吸煙是肺癌發(fā)生的危險因素，尼古丁等有害物質可破壞呼吸道上皮的完整性，通過再激活Hh信號通路來實現(xiàn)上皮細胞層修復?；罨腍h信號通路通過上調HHIP基因的表達，負反饋抑制Hh信號通路的持續(xù)活化。在病理條件下，則可出現(xiàn)Hh信號通路持續(xù)異常激活，導致Shh及Glil、Gli2呈現(xiàn)過度表達，激活下游基因的轉錄，細胞增生失去調控，增生紊亂甚至惡變，過度活化致惡性腫瘤的發(fā)生[19]。Watkins等在肺癌組織中檢測到Shh和Glil的共表達及HHIP的表達下降，缺乏HHIP基因反饋抑制的Hh信號通路持續(xù)活化，維持惡性腫瘤細胞活性使其不斷增殖、生長[20]。

4　結論

吸煙是導致肺癌的主要危險因素，但有約80%的吸煙人群不會罹患肺癌，同樣對于COPD患者，也有部分病例無并發(fā)肺癌的傾向[1]。那么對于不同遺傳背景的人群，研究其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly morphism，SNP)有助于解釋個體的表型差異以及不同群體和個體對疾病的易感性。單核苷酸多態(tài)性是指在基因組內某一特定核苷酸位置上存在轉換、顛換等變化，SNP的位點極其豐富，幾乎遍及整個基因組，不同人群中，SNP的分布存在差異。本研究以漢族人群中COPD合并肺癌患者465例為研究對象，同期單純COPD患者207例作為對照， 旨在通過對照設計研究探討HHIP基因多態(tài)性與COPD并發(fā)肺癌風險之間的關系，分別選取6個MAF大于5%的多態(tài)性位點rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420進行分型和監(jiān)測。經(jīng)統(tǒng)計學分析,以上多態(tài)性位點在2組患者差異無統(tǒng)計學意義。因本研究樣本量較少，具有一定的局限性，還有加大樣本量后做進一步的研究。

[1]Fang X,Wang X,Bai C.COPD in China:the burden and importance of propermanagement[J].Chest,2011,139(4):920-929.

[2]Young RP, Whittington CF, Hopkins RJ，etal. Chromosome 4q31 locus in COPD is alsoassociated with lung cancer[J].Eur Respir J, 2010, 36(6): 1375-1382.

[3]張增利，周彩存，張頡，等.DNA 修復基因 ERCC1 多態(tài)性與肺癌易感性的關系[J].中國肺癌雜志，2008, 11(2):183-188.

[4]Hoshino T, Kato S, Oka N,etal. Pulmonary inflammation and emphy sema :role of th e cytokines IL -18 an d IL -13[J]. Am J Re -spir C rit Care Med， 2007， 176(1) : 49 -62.

[5]Zhou W, Liu G, Park S,etal. Gene-smoking interaction association for the ERCC1 polymorphisms in the risk of lung cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005, 14(2): 491-496.

[6]Thorgeirsson TE, Geller F, Sulem P,etal. A variant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease[J]. Nature, 2008, 452(7187):638-642.

[7]陶娟.細胞因子在慢性阻塞性肺病發(fā)病中的作用[J].西部醫(yī)學,2010,22(6):1122-1125.

[6]Kaed H,Kleeff J,Keleg S,etal.Indian hedgehog signaling pathway:expression and regulation in pancreatic cancer[J].Int J Cancer,2004,110(5):668-676.

[8]Pillai SG,Kong X,Edwards ID,etal.Loci identified by genome-wide association studies influence different disease-related phenotypes in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med,2010,182(12):1498 -1505.

[9]白澎，孫永昌．慢性阻塞性肺疾病合并癥研究進展[J].國際呼吸雜志，2011， 31(9) :700-703.

[10] Tada M,Kanai F,Tanaka Y,etal.Down regulation of hedgehog interacting protein through genetic and epigenetic alterations in human hepatocellular carcinoma.[J]Clin Cancer Res,2008,14(12):3768-3776.

[11] Van Der Pouw Kraan TC， Kucukaycan M， Bakker AM，etal.Chronic obstructive pulm onary disease is associated with the 1055 IL -13 prom oter polymorphism[J]. Genes Immun， 2002， 3 :436 -439.

[12] Samara KD，Tzortzaki EG，Neofytou E，etal．Somatic DNA alterationsin lung epithelial barrier cells in COPD patients [J]．PulmPharmacol Ther，2010，23(3) : 208-214.

[13] Spitz MR, Wei Q, Dong Q，etal. Genetic susceptibility to lung cancer: the role of DNA damage and repair [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003, 12(8): 689-698.

[14] Brennan P, Buffler PA, Reynolds P,etal. Secondhand smoke exposure in adulthood and risk of lung cancer among never smokers: a pooled analysis of two arge studies [J]. Int J Cancer, 2004, 109(1): 125-131.

[15] Brüske-Hohlfeld I. Environmental and occupational risk factors for lung cancer [J].Methods Mol Biol, 2009, 472: 3-23.

[16] Young RP，Hopkins RJ．COPD and lung cancer linked at a molecular genetic level[J]．Chest， 2011，140(1) : 266- 267.

[17] 高歡玲．TNF-α和 IL-6 基因多態(tài)性與 COPD 易感性的關系研究[D]．太原：山西醫(yī)科大學，2010: 80-90.

[18] Madison BB,Braunstein K,Kuizon E,etal.Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis[J].Development,2005,132(2):279-289.

[19] Van Der Pouw Kraan TC, Kucukaycan M, Bakker AM,etal.Chronic obstructive pulm onary disease is associated with the 1055 IL -13 prom oter polymorphism[J]. Genes Immun, 2002, 3:436 -439.

[20] Watkins DN,Berman DM,Burkholder SG,etal.Hedgehog signalling with in airway epithelial progenitors and in small-cell lung cancer[J].Nature,2003,422(6929):313-317.

Association of HHIP gene polymorphism and lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history

WANG Haitao,XU Jing,ZHANG Shu,et al

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheSeventhPeople′sHospitalofShanghai,UniversityofTCM,Shanghai200137,China)

ObjectiveTo investigate the association of HHIP gene (protein Hedgehog-interacting, HHIP) polymorphism with the risk of lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history. Methods672 patients with COPD were used as the research object. According to the condition of the patients, the patients were divided into test group (patients with COPD and lung cancer.n=265) and observation group (patients with unilateral chronic obstructive pulmonary disease (COPD),n=207). By using the ligase detection reaction (ligase detection reaction, LDR), polymorphism of HHIP gene at rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were detected. SNP genotype and lung cancer risk were analyzed. Results HHIP of rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs7689420, rs1492820 and rs1489758 were accord with Hardy·Weinberg equilibrium test (P>0.05), which were representative of the population. Logistic regression analysis showed that HHIP gene polymorphism of rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were not related to and COPD patients with lung cancer (P>0.05). ConclusionThere is a clear correlation between the 6 polymorphisms of HHIP gene and the risk of lung cancer in Chinese Han COPD patients.

HHIP; COPD; Gene polymorphism analysis; Lung cancer; LDR

上海市衛(wèi)計委青年科研項目(20124y115)

許靖,E-mail:xujing311@163.com

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.021

2016-01-06； 編輯： 張文秀)