馬憲魯 鄭寶石 馮旭 謝曉勇 黃柳柳 羅程

心臟不停跳二尖瓣置換術(shù)對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達影響的研究及意義

馬憲魯 鄭寶石 馮旭 謝曉勇 黃柳柳 羅程

目的 探討心臟不停跳二尖瓣置換術(shù)（MVR）對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)因子GRP78/Caspase-12在心肌表達的影響及對心肌保護的意義。方法 選取擇期行MVR的風濕性心臟?。≧HD）二尖瓣狹窄（MS）患者40例，隨機分為心臟不停跳組（BH組，n=20）和心臟停跳組（CA組，n=20），分別于體外循環(huán)（CPB）轉(zhuǎn)流開始前（T0）、主動脈阻斷30 min后（BH組為CPB開始后30 min，T1）及縫合右心房前（T2）收集右心房心肌組織，通過rt-PCR法檢測兩組心肌GRP78和Caspase-12的表達，同時采用免疫組織化學法檢測兩組心肌GRP78和Caspase-12陽性著色情況。結(jié)果 兩組GRP78mRNA表達：CA組T0為0.088±0.009、T1為0.193±0.024、T2為 0.516±0.037，BH 組 T0為 0.085±0.008、T1為 0.189±0.022、T2為 0.229±0.038，兩組 GRP78mRNA 在T1時段表達量均增高（P＜0.05），在T2時段表達量增高且CA組表達量高于BH組（P＜0.05）。兩組Caspase-12 mRNA 表達：CA 組 T0為 0.205±0.037、T1為 0.341±0.032、T2為 0.912±0.051，BH 組 T0為 0.198±0.035、T1為0.209±0.035、T2為 0.307±0.063，CA 組 Caspase-12 mRNA 的表達量在 T1、T2時段均增高（P＜0.05），BH 組僅在T2時段表達增高（P＜0.05）；CA 組在 T1、T2時間段 Caspase-12 mRNA 表達量均高于 BH 組（P＜0.05）。T2時段CA組與BH組GRP78蛋白免疫組化染色結(jié)果為62.74±8.12和35.59±4.09，CA組高于BH組（P＜0.05）；T2時段CA組與BH組Caspase-12蛋白免疫組化染色為69.60±5.54和26.48±2.29，CA組高于BH組（P＜0.05）。結(jié)論 心臟不停跳MVR能夠通過減輕心肌ERS反應(yīng)，提高手術(shù)過程中的心肌保護作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；心臟不停跳；天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；心肌保護

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）心臟停跳手術(shù)對術(shù)后心功能影響的主要因素是心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），主要表現(xiàn)為心肌細胞凋亡[1]。如何減輕MIRI過程引起的心肌細胞凋亡一直是心肌保護研究的工作重點。心肌缺血缺氧能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS 是除了線粒體調(diào)控通路和配體蛋白直接信號調(diào)控通路的一種新的細胞凋亡信號通路，過度的ERS能夠加重MIRI引起的心肌損傷[2]。研究表明，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein，GRP78）是 ERS反應(yīng)的敏感標記物[3]，而天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）是ERS反應(yīng)中特有的蛋白[4]。目前有關(guān)ERS相關(guān)因子與心肌細胞凋亡的研究主要集中在動物實驗階段，臨床報道較少。本研究通過檢測ERS相關(guān)因子GRP78和Caspase-12在兩種二尖瓣置換手術(shù)患者的表達，探討心臟不停跳術(shù)式能否通過減輕ERS來提高心肌保護。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取濟寧市第一人民醫(yī)院心外科2015年9月至2016年3月心臟外科收治的風濕性心臟?。≧HD）/二尖瓣狹窄（MS）擇期行二尖瓣置換術(shù)（MVR）的患者40例，男性 22例，女性18例，年齡（44.7±6.2）歲，體質(zhì)量（55.1±6.7）kg，心胸比例（0.64±0.05），血壓（122.7±9.4/66.5±5.7）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。根據(jù)手術(shù)方式不同分為心臟停跳組（n=20，CA組）及心臟不停跳組（n=20，BH組）。CA組男性11例，女性9例；BH組男性11例，女性9例。所有患者術(shù)前均無冠脈相關(guān)疾病、重度心功能不全、甲狀腺功能亢進、糖尿病、高血壓、主動脈瓣狹窄及關(guān)閉不全、重要臟器功能不全，近1個月未服用可能對本次研究結(jié)果造成影響的藥物。兩組患者年齡、體質(zhì)量、血壓、心胸比例、二尖瓣瓣口面積（MVA）、二尖瓣跨瓣壓差（MVP）、左室舒張末容積（LVEDV）比較未見統(tǒng)計學差異。

1.2 手術(shù)方法 兩組患者均采用胸前正中切口入路，縱劈胸骨打開并懸吊心包后顯露術(shù)野，主動脈、上下腔靜脈及左心房插管后開始CPB轉(zhuǎn)流。BH組：CPB并循環(huán)降溫至鼻咽溫度為32℃左右，收緊上、下腔靜脈阻斷帶，但不阻斷升主動脈，使心肌始終有溫氧合血灌注，CPB過程中平均動脈壓保持在60 mm Hg以上，鼻咽溫維持在（32.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)流中灌注流量控制在（30.0±0.2）L·min-1·m-2，不灌注心臟停跳液，使心臟在緩慢空跳40～60次/min狀態(tài)下通過右心房-房間隔途徑進行MVR。CA組：阻斷升主動脈后主動脈根部順行灌注溫血（37℃）停搏液和晶體停搏液按4∶1比例混合的改良St.ThomasⅡ停跳液，心包腔內(nèi)置入冰屑使心肌表面溫度降低，心臟停跳后通過右心房-房間隔途徑行MVR。

1.3 標本數(shù)據(jù)采集 分別于打開右心房時（T0）、主動脈阻斷后30 min時（BH組取CPB開始30 min，T1）、縫合右心房時（T2）采集右心房心肌組織，去除血液、脂肪，生理鹽水沖洗。修剪心肌組織，大小約2 mm×2 mm×2 mm，置入含有RNAstore液的凍存管中，放置-80℃冰箱中保存用以提取RNA。修剪右心房心肌組織，大小約4 mm×4 mm×4 mm，置入含有4%甲醛液的試管中密封常溫保存，24 h后進行脫水、石蠟包埋、切片后用以免疫組織化學染色。該研究方案符合《赫爾辛基宣言》所申明的原則和條款，并得到我院倫理委員會的批準與備案，家屬均簽訂知情同意書。

1.4 心肌Caspase-12和GRP78mRNA表達檢測稱取心肌組織30 mg提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，OD260/OD280比值在1.75～2.00范圍內(nèi)的RNA樣品為合格樣品。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)測定Caspase-12和GRP78mRNA表達，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中下載人Caspase-12、GRP78和β-Action基因序列。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物系列如下Caspase-12：F5′-ACAAGCTGGTCCACTGAGAG-3′，R5′-ACCAGAACACCGTTGGATGG-3′；GRP78：F5′-ACTCCTGAAGGGGAACGTCT-3’，R5′-CCACCTTGAACGGCAAGAAC-3′；β -Action：F5′-CAGGCACCAGGGCGTGAT-3′，R5′-TAGCAACGTACATGGCTGGG-3′。依照試劑盒指示建立反應(yīng)體系，β-Action作為內(nèi)參照基因分別將β-Action與Caspase-12和GRP78在同一反應(yīng)體系內(nèi)進行擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。β-Action與Caspase-3基因產(chǎn)物長度分別為293 bp與181 bp，反應(yīng)結(jié)束后，按儀器默認條件收集熒光，把離心管迅速放入PCR擴增儀，按擴增程序進行PCR擴增，收集擴增曲線及熔解曲線。見圖1。

1.5 心肌Caspase-12和GRP78免疫組化陽性染色 參照Caspase-12和GRP78的中衫金橋PV9000試劑盒進行：60度烤片1 h，二甲苯與梯度乙醇脫蠟與水化后蒸餾水沖洗，微波爐最小火10 min進行抗原修復(fù)，3%過氧化氫處理10 min除去內(nèi)源性過氧化物酶，1∶50～1∶200 一抗 4 ℃孵育過夜，加入試劑1后室溫孵育25 min，加入試劑2后室溫孵育25 min，每步驟結(jié)束后PBS緩沖液洗片3 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑染色5 min，自來水沖洗10 min，蘇木素復(fù)染5 min，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水后透明，中性樹脂封片。使用光學顯微鏡分別觀察兩組心肌細胞Caspase-12和GRP78的表達情況。40高倍光學顯微鏡觀察，隨機選取5個不重疊的視野，分別計數(shù)陽性著色細胞。Caspase-12染色鏡下細胞核為紫藍色，細胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)陽性染色棕褐色。見圖2。

1.6 統(tǒng)計學方法 本研究采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立相關(guān)t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組手術(shù)結(jié)果及相關(guān)資料比較 兩組患者術(shù)后均痊愈出院。術(shù)后無低心排綜合征、肺部感染、重要臟器功能不全、抗凝過度、再次開胸手術(shù)等嚴重并發(fā)癥。

2.2 心肌Caspase-12和GRP78 mRNA表達結(jié)果

Caspase-12 mRNA表達：CA組 Caspase-12 mRNA的表達量在T1時段開始增高，在T2時段顯著增高（P＜0.05），BH 組僅在 T2時段表達增高（P＜0.05）；CA 組在 T1、T2時間段 Caspase-12 mRNA 表達量均高于BH組（P＜0.05）。GRP78 mRNA表達：兩組GRP78 mRNA的表達量在T1時段都有所增高，在T2時段CA組GRP78 mRNA增高的表達量高于BH組（P＜0.05）。見表1。

2.3 心肌Caspase-12和GRP78免疫組化染色結(jié)果 分別觀察兩組心肌細胞Caspase-12和GRP78的表達情況：兩組Caspase-12在T2時陽性著色數(shù)均較T0時增高（P＜0.05），CA組在T2時陽性著色數(shù)明顯高于BH組（P＜0.05）；兩組GRP78在 T2時陽性著色數(shù)均較T0時增高（P＜0.05），CA組在T2時陽性著色數(shù)明顯高于BH組（P＜0.05）。見表2、圖2。

表1 兩組Caspase-12和GRP78 mRNA在不同時間段表達（±s）

表1 兩組Caspase-12和GRP78 mRNA在不同時間段表達（±s）

注：Caspase-12：天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶 12；GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78。與T0比較，aP＜0.05；與 T1比較，bP＜0.05；與CA組比較，cP＜0.05

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表 2 Caspase-12、GRP78 的陽性表達結(jié)果（±s）

表 2 Caspase-12、GRP78 的陽性表達結(jié)果（±s）

注：Caspase-12：天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12；GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78。與 T0比較，aP＜0.05；與 CA 組比較，bP＜0.05

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3 討論

CPB下心臟停跳手術(shù)對于心肌的影響主要是MIRI后的心肌細胞凋亡。為減少上述情況的發(fā)生，加強術(shù)中心肌的保護主要是采用淺低溫（32℃～35℃）下心臟跳動中進行心內(nèi)直視手術(shù)[5]。該方式在術(shù)中通過降低心率，保證冠狀動脈對心肌的持續(xù)血液供應(yīng)，維持心肌細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在一定程度上避免了MIRI。由于心肌細胞具有高能量代謝特點，決定了在阻斷主動脈心臟停跳后的缺血、缺氧導(dǎo)致心肌細胞ATP與營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗后不能及時補充，出現(xiàn)能量代謝障礙誘發(fā)ERS[6]。在開放主動脈，心臟恢復(fù)血供，心肌出現(xiàn)血液再灌注后，心肌細胞產(chǎn)生大量氧自由基、Ca2+超負荷等又加重了ERS[7]。ERS發(fā)生激活了高度保守的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），該反應(yīng)能夠提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工及重新折疊蛋白質(zhì)的能力，同時清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的受損傷蛋白，維持細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BiP），作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)性分子伴侶蛋白，是ERS的經(jīng)典標志物[9]。在ERS時GRP78可通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇依賴酶-1（IRE1）及轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）這三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白所介導(dǎo)的UPR結(jié)合[10]。過多的錯誤折疊和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常聚集時，會誘發(fā)GRP78表達，從而激活PERK、IRE1、ATF6的表達。前者與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊的蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象；后者抑制ERS反應(yīng)[11]。本研究中兩組GRP78在T1時段表達量都有增高，說明CPB開始時由于心肌缺血缺氧以及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生等因素誘發(fā)ERS；在T2時段BH組GRP78表達增加較CA組低，說明心臟不停跳狀態(tài)下ERS強度平穩(wěn)，維持在輕度應(yīng)激水平；而CA組GRP78表達量顯著增高，說明心臟停跳下心肌缺血、缺氧以及恢復(fù)血供后再灌注等導(dǎo)致過強的ERS反應(yīng)，加重心肌損傷。

天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶12（Caspase-12）作為凋亡蛋白酶（Caspase）家族成員之一，也是ERS的經(jīng)典標志物[9]。ERS反應(yīng)介導(dǎo)細胞凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase蛋白酶，而特征性Caspase-12僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，ERS時GRP78與無活性的前體Caspase-12（pro-Caspase-12）結(jié)合，過度 ERS 時導(dǎo)致該復(fù)合物裂解，釋放活性的Caspase-12[12]。Caspase-12在ERS是表達量增高激活同族成員Caspase-9后間接或者直接激活同族成員Caspase-3表達介導(dǎo)細胞凋亡[13]。朱漢華等[14]在大鼠實驗時發(fā)現(xiàn)，冠脈微栓塞心肌缺血后心肌細胞凋亡中Caspase-12表達水平升高，并參與了心肌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，CA組Caspase-12表達量在T1時段即有升高，在T2時段顯著升高，說明在心肌缺血缺氧時即發(fā)生ERS，同時在MIRI過程中通過ERS途徑激活參與心肌細胞凋亡。BH組中Caspase-12僅在T2時表達增高，且較CA組相應(yīng)時段低，說明心臟不停跳術(shù)式可以減輕ERS在MIRI中介導(dǎo)心肌細胞凋亡。

圖1 Caspase-12與GRP78擴增與熔解曲線

圖2 兩組T2時間段免疫組化法Caspase-12和GRP78染色結(jié)果（×400）

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Study the myocardial expression of GRP78/Caspase-12 in beating heart mitral valve replacement

MA Xian-lu＊，ZHENG Bao-shi，F(xiàn)ENG Xu，et al.＊Department of Cardiac Surgery，Jining NO.1 People′s Hospital，Jining 272011，China

ZHENG Bao-shi，E-mail：zhengbs25@vip.sina.com

Objective To observe the influence about the expression of related factors GRP78/Caspase-12 about endoplasmic reticulum stress（ERS） in beating heart mitral valve replacement and study the significance of myocardial protection.Methods 40 patients with rheumatic heart disease mitral stenosis were randomly divided into beating heart group（BH，n=20）and cardiac arrest group（CA，n=20），both of them were accepted MVR by beating heart surgery and cardiac arrest surgery under cardiopulmonary bypass（CPB）respectively.Right atrial myocardial tissue were collected at prior the start of CPB （T0），after aortic cross-clamping 30 minutes（BH group in the beginning 30 minutes after CPB，T1）and stitched right atrium （T2）respectively.Using the method of reverse transcriptase polymerase chain reaction（rt-PCR）detection the expression level of GRP78 and Caspase-12 in two groups.Observing the myocardial tissue slices positive expression about GRP78 and Caspase-12 by immunohistochemical.Results The expression of GRP78 in two groups：CA group T0（0.088±0.019），T1（0.223±0.024），T2（0.516±0.037）；BH group T0（0.085±0.022），T1（0.189±0.022），T2（0.259±0.038）.The expression of GRP78 had increased at T1in two groups（P＜0.05），CA group expressed higher than the BH group at T2（P＜0.05）.The expression of Caspase-12 in two groups：CA group T0（0.202±0.033），T1（0.361±0.042），T2（0.852±0.051）；BH group T0（0.198±0.034），T1（0.211±0.030），T2（0.327±0.053）.Caspase-12 in CA group expressed heighten at T1and T2（P＜0.05），Caspase-12 in BH group had increased in T2only（P＜0.05）.Caspase-12 in CA group expressed higher than the BH group at T1and T2（P＜0.05）.The staining results of immunohistochemical about GRP78 in CA and BH at T2were（62.74±8.12）and（35.59±4.09），CA group higher than BH（P＜0.05）.The results of Caspase-12 in CA and BH at T2were（69.60±5.54）and（26.48±2.29），CA group higher than BH（P＜0.05）.Conclusion MVR of beating heart can reduce the reaction of ERS to enhance the myocardial protection under CPB.

Endoplasmic reticulum stress；Beating heart surgery；Caspase-12；GRP78；Myocardial protection

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（項目編號：桂科攻1355005-2-3）；廣西自然科學基金項目（項目編號：2013GXNSFAA192052）

272011 山東省濟寧市，濟寧市第一人民醫(yī)院心外科（馬憲魯、張申、周成運）；廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟外科（鄭寶石、馮旭、謝曉勇）

鄭寶石，E-mail:zhengbs25@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.12.019

R654.2

A

1672-5301（2016）12-1123-04

2016-05-26）