尹志永　楊大勇　楊立豐　李　華　王鐵軍　陳麗娜.河北省秦皇島市第二醫(yī)院胸外科，河北秦皇島　066600；.河北省秦皇島市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北秦皇島066600；.河北省秦皇島市第二醫(yī)院檢驗科，河北秦皇島　066600

切除修復交叉互補基因1、核糖核苷酸還原酶M 1亞基和3型β微管蛋白分子檢測指導晚期非小細胞肺癌個體化治療的臨床效果

尹志永1楊大勇1楊立豐2李華3王鐵軍3陳麗娜1
1.河北省秦皇島市第二醫(yī)院胸外科，河北秦皇島066600；2.河北省秦皇島市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北秦皇島066600；3.河北省秦皇島市第二醫(yī)院檢驗科，河北秦皇島066600

目的 探討切除修復交叉互補基因1（ERCC1）、核糖核苷酸還原酶M1亞基 （RRM1）和3型β微管蛋白（TUBB3）分子檢測在指導晚期非小細胞肺癌（NSCLC）個體化治療的臨床效果。方法 將2013年1～11月秦皇島市第二醫(yī)院胸外科住院治療的48例經(jīng)病理確診的晚期NSCLC患者分為實驗組（20例）和對照組（28例）。實驗組采用SYBR熒光實時定量PCR檢測方法檢測患者胸水或靜脈血中ERCC1、RRM1和TUBB3的表達量，根據(jù)表達情況選擇化療方案；對照組則均采用順鉑與吉西他濱聯(lián)合治療。經(jīng)過2個周期治療后比較兩組的療效、不良反應及疾病進展、生存獲益情況。結果 實驗組的總有效率和總控制率均顯著高于對照組（P＜0.05）；實驗組和對照組治療后的PS評分均顯著高于治療前（P＜0.05），但兩組治療后的PS評分、PS評分改善率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組間不良反應發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且兩組間不同系統(tǒng)的不良反應嚴重程度差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。 結論 實時定量PCR技術檢測病理組織的ERCC1、RRM1和TUBB3表達水平用于指導晚期NSCLC患者個體化治療，可提高治療有效率和疾病控制率，但在改善生活質量和減少不良反應發(fā)生效果不顯著，建議進一步探索標志物指導下更為有效的化療方案。

切除修復交叉互補基因1；核糖核苷酸還原酶M 1亞基；3型β微管蛋白；非小細胞肺癌；化療

肺癌是最常見的腫瘤之一，目前已成為造成患者死亡的首位癌癥。其中NSCLC最為常見，占所有肺癌的80%以上。隨著目前臨床的不斷研究，化療為NSCLC的首選治療方法，且順鉑、吉西他濱等化療藥物對NSCLC的療效顯著［1-2］。但是隨著療程的持續(xù)治療，耐藥現(xiàn)象逐漸突出，藥物效果逐漸下降。本研究通過對比分析以胸水或靜脈血中切除修復交叉互補基因1（ERCC1）、核糖核苷酸還原酶M1亞基（RRM1）和3型β微管蛋白（TUBB3）表達量選擇化療方案與直接進行順鉑、吉西他濱聯(lián)合治療兩種化療方法的臨床效果和不良反應發(fā)生情況，探討ERCC1、RRM1與TUBB3檢測在指導晚期NSCLC個體化治療的臨床意義，現(xiàn)報道如下：

1　資料與方法

1.1一般資料

隨機選取2013年1～11月秦皇島市第二醫(yī)院胸外科住院治療的晚期NSCLC患者48例，其中男26例，女22例，平均年齡（55.17±12.47）歲；其中鱗狀細胞癌23例、腺癌25例?；颊叻譃閷嶒灲M和對照組，其中實驗組20例，男 12例，女 8例，平均年齡（54.50± 10.79）歲，鱗狀細胞癌8例、腺癌12例，腫瘤分期Ⅲ期b8例、Ⅳ期12例；對照組28例，男14例，女14例，平均年齡（55.57±11.24）歲，鱗狀細胞癌15例、腺癌13例，腫瘤分期Ⅲb期11例、Ⅳ期17例。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準［3］：①臨床癥狀符合NSCLC診斷標準；②經(jīng)CT檢查證實存在腫瘤病灶，均經(jīng)氣管鏡活檢或穿刺或胸水病理確診；③腫瘤分期屬于Ⅲb和Ⅳ期；④初診且未經(jīng)過治療；⑤體力狀況評分（ECOG PS評分）小于3分（5分法），且生存期大于3個月。

排除標準［3］：①患有感染性疾病、肝腎疾病、慢性心臟病等疾病；②合并其他系統(tǒng)疾病。

1.2ERCC1、RRM 1和TUBB3基因表達檢測

腫瘤相關基因mRNA表達水平實時熒光定量PCR檢測試劑盒為南京生興生物公司生產(chǎn)。血液（液體樣本）總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）、cDNA合成試劑盒、pGM-T載體試劑盒均為Bioteke公司產(chǎn)品。在實驗組患者入組后（未開展化療）進行穿刺獲得胸水（40 mL）或抽取靜脈血（10 mL）做為樣本，按照試劑盒操作步驟首先進行總RNA提取，通過瓊脂凝膠電泳檢測其純度，并使用分光光度儀測得D260nm/ D280nm在1.7～2.1。然后按照cDNA合成試劑盒操作步驟進行cDNA合成，將所得cDNA經(jīng)PCR擴增后得到目的DNA。選用pGM-T載體試劑盒進行TA克隆，所得質粒進行PCR鑒定，并測序鑒定所得產(chǎn)物序列的正確性。選用腫瘤相關基因mRNA表達水平實時熒光定量PCR檢測試劑盒，按操作步驟進行，將質粒標準品及管家基因質粒標準品等比稀釋成6個濃度后進行SYBR熒光實時定量PCR檢測，反應條件：聚合酶的活化時間20 s；雙鏈DNA在95℃變性，再迅速冷卻至60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至72℃，使引物鏈沿模板延伸；PCR擴增循環(huán)次數(shù)40個循環(huán)。檢測出質粒樣本中ERCC1、RRM1和TUBB3基因的mRNA表達量，按照表達量的多少分為無表達、低表達和高表達。

1.3個體化化療方案

實驗組患者根據(jù)ERCC1、RRM1和TUBB3基因表達量確定化療方案：ERCC1基因低表達或無表達者采取以鉑類為主的兩種藥物治療，RRM1基因低表達或無表達者采取吉西他濱單藥治療或以吉西他濱為主的兩種藥物治療，TUBB3基因高表達者需避免使用紫杉類化療藥物。實驗組共計出現(xiàn)以下4類情況：ERCC1和RRM1低表達或無表達，而TUBB3基因高表達者5例，采取順鉑與吉西他濱共同治療；ERCC1、RRM1和TUBB3基因均呈現(xiàn)低表達或無表達8例，采取順鉑與吉西他濱共同治療；ERCC1和TUBB3基因高表達，而RRM1低表達或無表達3例，采取吉西他濱單獨治療；ERCC1和RRM1高表達，而TUBB3基因低表達者4例，采取多西他賽單獨治療。對照組患者均采取順鉑與吉西他濱共同治療。用藥劑量根據(jù)體表面積給予常規(guī)治療，嚴重者可適當加量。用藥期間患者若出現(xiàn)惡心、嘔吐、白細胞降低、出血、轉氨酶升高等不良反應，其嚴重程度具體參照WHO化學藥物毒副作用評定標準［4］評定等級，輕度：Ⅰ級+Ⅱ級，重度：Ⅲ級+Ⅳ級。可適當給予止吐、升白、補充血小板、保肝等對癥治療以緩解不良反應。

1.4療效判斷

在患者化療2個周期后進行療效判斷，判斷標準為RECISE1.0。判定結局包括部分緩解（PR）、完全緩解（CR）、穩(wěn)定（SD）和進展（PD），部分緩解和完全緩解合計為有效，部分緩解、完全緩解和穩(wěn)定合計為疾病控制，計算總有效率和疾病控制率 ［總有效率=（PR+ CR）/總例數(shù)×100%、疾病控制率=（PR+CR+SD）/總例數(shù)×100%］。分別在治療前后對患者進行PS評分［5］，以治療前后評分差值（治療后-治療前）判定化療對患者生活質量的改善效果：①部分改善：差值=1；②完全改善：差值≥2；③穩(wěn)定：差值=0；④下降：差值≤1?？偢纳坡?（部分改善+完全改善）/總例數(shù)×100%。同時分析兩組治療期間各系統(tǒng)不良反應發(fā)生率及其嚴重程度。

1.5統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（M）及四分位數(shù)間距（Q）或四分位數(shù)（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組療效比較

化療2個周期后，實驗組20例患者中PR、CR、SD和PD分別為13例（65.00%）、0例（0.00%）、4例（20.00%）和3例（15.00%），對照組28例患者中PR、CR、SD和PD分別為9例（32.14%）、1例（3.57%）、6例（21.43%）和12例（42.86%），兩組總有效率分別為65.00%和35.71%，疾病控制率分別為85.00%和57.14%，實驗組的總有效率和總控制率均顯著高于對照組（χ2=4.009、4.214，P=0.045、0.040）。

2.2兩組治療前后PS評分比較

實驗組和對照組治療后的PS評分均顯著高于治療前（t=2.302、2.216，P＜0.05），但兩組間治療前及治療后的PS評分差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=0.061、0.202，P=0.806、0.655）。實驗組和對照組的PS評分改善率分別為60.00%和57.14%，兩組間PS評分改善率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.042，P=0.841）。見表1。

表1　兩組治療前后PS評分比較

2.3兩組治療期間不良反應發(fā)生情況比較

實驗組治療期間有17例（85.00%）患者發(fā)生不良反應，其中涉及消化系統(tǒng)7例（35.00%）、血液系統(tǒng)8例（40.00%）、其他2例（10.00%）；對照組治療期間有27例（96.42%）患者發(fā)生不良反應，其中單獨涉及消化系統(tǒng)6例（21.43%）、血液系統(tǒng)13例（46.43%）、其他2例（7.14%）、同時涉及消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)4例（14.29%）、同時涉及血液系統(tǒng)和其他系統(tǒng)2例（7.14%）。兩組間不良反應發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義 （χ2=0.779，P= 0.377），且兩組間消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的不良反應嚴重程度差異也均無統(tǒng)計學意義（χ2=0.000，P=1.000）。見表2。

表2　兩組治療期間不良反應發(fā)生情況比較［n（%）］

3　討論

近年來肺癌的發(fā)病率一直趨于攀升狀態(tài)，已經(jīng)成為目前造成人群死亡的最主要疾病之一。早期放射治療、化學治療和手術治療為腫瘤治療的主要方法，其中化學治療應用最為廣泛。隨著第三代化療藥物吉西他濱的開發(fā)應用，吉西他濱聯(lián)合順鉑的化療方案得到臨床認可和廣泛應用［6-7］。但是隨著臨床NSCLC患者的化療觀察，發(fā)現(xiàn)吉西他濱聯(lián)合順鉑化療方案雖可顯著改善患者的生活質量和提高生存時間，但是個體間療效差異大，一些患者在治療無效的情況下還要經(jīng)歷藥物的毒副作用，患者總生存率在40%以下［8-9］。為了更好地診治NSCLC患者，提高化療的有效率和生存率，臨床上開發(fā)出一種新的化療思路，即個體化化療。此化療思路及考慮癌癥患者藥物基因組學和藥物遺傳學特點，選擇最佳且特異的化療藥物方案進行化療。個體化化療方案已在臨床上得到廣泛認可和應用，經(jīng)臨床觀察，該方法可顯著提高化療的針對性，提高治療有效率的同時還可最大程度的延長生存時間［10］。

研究發(fā)現(xiàn)ERCC1、RRM1與TUBB3基因的表達與晚期NSCLC化療療效密切相關，可用于指導晚期NSCLC化學治療。ERCC1是人體內(nèi)眾多DNA損傷修復基因中的一種，同時還是核苷酸切除修復通路中起關鍵作用的一種酶，ERCC1的表達與鉑類-DNA加合物的消除過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)：ERCC1高表達可導致SNP，繼而引起鉑類藥物耐藥以及加速鉑類藥物所引起的DNA加合物消除，降低鉑類藥物療效［11］。RRMl位于染色體中的llpl5.5片段，NSCLC患者該區(qū)域?？沙霈F(xiàn)雜合子缺失。研究發(fā)現(xiàn)：RRM1與肺癌患者吉西他濱耐藥密切相關，RRM1是人體內(nèi)核糖核酸還原酶的重要組成部分，參與脫氧核苷酸的生產(chǎn)，是人體內(nèi)DNA修復和合成的限速酶，RRM1mRNA高表達者常可表現(xiàn)為對吉西他濱耐藥，該患者接受順鉑或者抗微管藥物（紫杉烷類、長春瑞濱等）治療效果較好［12］。隨著抗微管藥物在臨床的不斷使用，研究顯示該類藥物耐藥與體內(nèi) TUBB3表達密切相關，TUBB3高表達患者在使用抗微管類藥物時療效較其他化療藥物差［13-14］。

本研究利用ERCC1、RRM1與TUBB3基因表達情況選擇患者個體化化療方案為實驗組，采用順鉑與吉西他濱聯(lián)合統(tǒng)一治療為對照組，對比分析發(fā)現(xiàn)：實驗組的總有效率（65.00%）和總控制率（85.00%）均顯著高于對照組（35.71%、57.14%）（P＜0.05），提示個體化化療可提高化療有效率。在改善生活質量上，兩組治療后的PS評分均顯著高于治療前（P＜0.05），而兩組間治療前及治療后的PS評分、PS評分改善率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示兩種治療方法均可改善患者生活質量，但兩種治療方法在改善生活質量上無差異；兩組不良反應總發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而且兩組間消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及其他系統(tǒng)的不良反應的嚴重程度差異也無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），提示個體化化療方案在改善不良反應的發(fā)生上作用不明顯。

綜上所述，實時定量PCR技術檢測胸水或靜脈血中ERCC1、RRM1和TUBB3表達水平用于指導晚期NSCLC患者個體化治療，可提高治療有效率和疾病控制率，但在改善生活質量和降低不良反應發(fā)生效果不顯著，建議進一步探索標志物指導下更為有效的化療方案。

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Clinical effect of ERCC1，RRM 1 and TUBB3 detection guiding individual chemotherapy for patients with advanced non-small-cell carcinoma

YIZhiyong1YANG Dayong1YANG Lifeng2LIHua3WANG Tiejun3CHEN Li'na1
1.Department of Thoracic Surgery，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao066600，China；2.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066600，China；3.Department of Laboratory，the Second Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066600，China

Objective To explore the clinical effect of excision repair cross complementary1（ERCC1），ribonucleofide reductase large subunit 1（RRM1）and tubulinβ3（TUBB3）molecular detection guiding advanced non-small-cell carcinoma（NSCLC）individualized treatment.Methods From January to November 2013，in the Second Hospital of Qinhuangdao City，48 patients with pathologically diagnosed advanced NSCLC were selected and divided into experiment group（20 cases）and control group（28 cases）.The experiment group were given SYBR real-time PCR testingmethods to detect expression levels of ERCC1，RRM1 and TUBB3 with pleural fluid or blood，according to the expression results，the chemotherapy schemewas chosen；the control group were given combination therapy with Cisplatin and Gemcitabine.The efficacy，toxicity and disease progression，survival benefit situation after two treatment cycles of two groups were compared.Results The total efficiency and total control rate in the experiment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）；PS scores after treatment in experiment group and control group were significantly higher than those before treatment（P＜0.05），the PS scores，PS score improvement rate in two groups after treatmentwere compared，the difference was not statistically significant（P＞0.05）；the incidence of adverse reactions in two groups was compared，the difference was not statistically significant（P＞0.05），and the severityof adverse reactions of different systems in two groups were compared，the differences were not statistically significant （P＞0.05）.Conclusion Real-time quantitative PCR to detect the expression levels of ERCC1，RRM1 and TUBB3 in pathology organization to guide individualized treating patients with advanced NSCLC can improve treatment efficiency and disease control rate，but it is not significant in improving the quality of life and reduce the occurrence of adverse，further to exploremore effective chemotherapy regimen under the guidance of themarkers is recommended.

Excision repair cross complementary1；Ribonucleofide reductase large subunit 1；Tubulinβ3；Nonsmall-cell carcinoma；Chemotherapy

R734.2

A

1673-7210（2016）01（b）-0081-04

2015-09-15本文編輯：蘇暢）

河北省秦皇島市科學技術研究與發(fā)展計劃項目（2012023A073）。

尹志永（1979.10-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：肺癌的個體化治療。