韋　琨　蔡　樂　劉　金　周　皓　曹秋娥云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明　650091

我校新開教學(xué)實驗“荷包牡丹堿的分離純化”的設(shè)計

韋琨蔡樂劉金周皓曹秋娥
云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650091

天然藥物化學(xué)是藥學(xué)專業(yè)的重要的專業(yè)必修課程，其配套實驗課程設(shè)計對于該課程的教學(xué)非常重要。云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院新開了一個天然藥物化學(xué)教學(xué)實驗——荷包牡丹堿的分離純化。本實驗通過甲醇超聲提取、硅膠柱層析劃段和甲醇重結(jié)晶三個步驟，即可從云南傳統(tǒng)中藥地不容中獲得純度較高的荷包牡丹堿。本實驗簡便、高效且易于操作，適合用于制藥工程專業(yè)本科生的實驗教學(xué)。

荷包牡丹堿；提取分離；天然藥物化學(xué)；制藥工程專業(yè)

天然藥物化學(xué)是制藥工程專業(yè)一門重要的專業(yè)必修課程，主要研究天然藥物主要有效成分的結(jié)構(gòu)類型、生源途徑、理化性質(zhì)、提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定等［1］。天然藥物化學(xué)實驗課程是為了更好地掌握天然藥物化學(xué)理論課程的教學(xué)內(nèi)容，配套設(shè)計的各類化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)表征實驗，是天然藥化理論知識和實際操作的紐帶，通過該實驗課程能夠更好地培養(yǎng)學(xué)生的實際操作能力和創(chuàng)新能力［2］。從傳統(tǒng)中藥或者藥用植物中提取分離天然活性成分，不僅可以解決很多活性化合物的來源以供活性篩選或藥用開發(fā)，而且可以推進中藥的現(xiàn)代化和國際化［3］。因而，進行天然活性化合物的提取分離工藝研究，并應(yīng)用于天然藥物化學(xué)實驗教學(xué)不僅具有很好的實用性，而且還能夠調(diào)動學(xué)生的實驗興趣和學(xué)習(xí)積極性，培養(yǎng)學(xué)生勇于創(chuàng)新的精神。

1　實驗研究對象的選擇

云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院制藥工程實驗教學(xué)團隊在設(shè)計教學(xué)試驗時注重實用性，力求在傳統(tǒng)實驗教學(xué)中結(jié)合云南省地方特色，開發(fā)新的適合制藥工程專業(yè)的天然產(chǎn)物化學(xué)教學(xué)實驗。地不容（Stephania epigaea）是云南著名的傳統(tǒng)中草藥（圖1），味苦而辛，性涼，有小毒，功能清熱解毒、鎮(zhèn)靜、理氣、止痛［4］。來自于防己科（Menispermaceae）千金藤屬植物，生長于濕熱河谷的石灰?guī)r上，俗名山烏龜、地膽、金不換等。在植物分類學(xué)上屬千金藤屬山烏龜亞屬，資源較為豐富［5-6］。研究表明，地不容中荷包牡丹堿的含量極高，荷包牡丹堿（dicentrine）屬于異喹啉類阿樸菲生物堿（圖1），屬于天然藥物化學(xué)教學(xué)內(nèi)容中的一類典型生物堿，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗癌［7-8］、腸道平滑肌解痙［9］、抗菌［10］及抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［11-12］。荷包牡丹堿的商品名為痛可寧，用于頭痛、牙痛、小手術(shù)后疼痛及神經(jīng)衰弱等。文獻調(diào)研未見關(guān)于荷包牡丹堿提取工藝的研究，將地不容中荷包牡丹堿的提取工藝應(yīng)用于本科教學(xué)，具有較好的云南地方特色，有利于提高學(xué)生對天然藥物化學(xué)的學(xué)習(xí)興趣。

圖1　地不容藥材和荷包牡丹堿的結(jié)構(gòu)

2　實驗方案的設(shè)計

經(jīng)過大量的前期研究，篩選了不同的提取方法、柱層析條件和重結(jié)晶條件等，結(jié)合教學(xué)實驗的條件和要求，最終確定了以下實驗方案：

2.1荷包牡丹堿的提取

取地不容藥材粉末50 g，采用甲醇超聲提取3次，每次使用甲醇200mL，每次超聲30min。抽濾，合并甲醇提取液，減壓濃縮回收甲醇得到粗提物。

2.2荷包牡丹堿的分離

首先是拌樣：取以上粗提物采用甲醇溶解進行拌樣，硅膠（100～200目）用量為5.0 g，樣品拌至完全干燥備用。然后是濕法裝柱：硅膠用量為40 g，采用石油醚150mL進行分散，裝入5 cm×30 cm的層析柱，把石油醚放至液面高出硅膠面2 cm左右（放出石油醚經(jīng)重蒸后可回收用于柱層析），靜置30 min使層析柱自然壓緊。此時把拌好的硅膠通過漏斗緩慢加入層析柱中，放干溶液。最后開始柱層析：采用石油醚-丙酮（4∶1）200 mL進行洗脫，棄去此部分洗脫液，繼續(xù)用石油醚-丙酮-二乙胺（60∶20∶1）200 mL進行洗脫，收集此部分洗脫液，減壓濃縮，所得物含荷包牡丹堿80%以上。

2.3重結(jié)晶

取以上主要含荷包牡丹堿的所得物，加入9～11mL甲醇進行溶解，若溶解困難可在水浴上微微加熱，溶解完畢后密閉，在4℃冰箱中靜置24 h后（也可直接放置到下次實驗時間），有沉淀析出，抽濾，用2～3mL甲醇洗滌固體，即可得到純度大于90%的荷包牡丹堿，自然陰干后稱重（得量約100 mg）。

2.4結(jié)構(gòu)表征

所得荷包牡丹堿首先通過與對照品進行薄層層析色譜（TLC）比較進行確定。顯色劑采用改良碘化鉍鉀試劑。展開劑選用氯仿-甲醇（4∶1），所得化合物與對照品Rf值一致，確定所得化合物為荷包牡丹堿。也可進一步通過核磁共振（NMR）進行結(jié)構(gòu)表征，以下是荷包牡丹堿的NMR數(shù)據(jù)：

荷包牡丹堿［13-14］：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 6.42（1H，s，H-3），3.08（1H，m，H-4a），2.58（1H，m，H-4b），3.04（1H，m，H-5a），2.41（1H，m，H-5b），3.01（1H，br s，H-6a），2.97（1H，dd，J=11.6，5.8 Hz，H-7a），2.45 （1H，dd，J=11.6，5.8 Hz，H-7b），6.72（1H，s，H-8），7.60 （1H，s，H-11），5.82［1H，s，（OCH2O）a］，5.98［1H，s，（OCH2O）b］，3.84，3.86（2×3H，2×s，9，10-OCH3），2.44 （3H，s，6-NCH3）；13C NMR （CDCl3，100 MHz）：δ146.4 （s，C-1），116.4（s，C-1a），126.3（s，C-1b），141.6（s，C-2），106.6（d，C-3），126.4（s，C-3a），29.0（t，C-4），54.4 （t，C-5），62.2（d，C-6a），34.0（t，C-7），128.2（s，C-7a），111.1（d，C-8），147.5（s，C-9），148.0（s，C-10），110.3（d，C-11），123.4（s，C-11a），100.4（t，OCH2O），55.6（q，9-OCH3），55.9（q，10-OCH3），43.8（q，6-NCH3）。

3　實驗教學(xué)中的注意事項

3.1藥材選擇

地不容藥材品種較多，本實驗所用藥材為千金藤屬地不容（S.epigaea）［15］，特別注意不要誤用葫蘆科雪膽屬植物雪膽［16］，購買時需準(zhǔn)確辨認(rèn)。此外，其他地不容中荷包牡丹堿含量不高，比如齒葉地不容［17］和河谷地不容［18］等，不能用于該實驗。

3.2粉碎程度

藥材粉碎不能過細(xì)，一般過24目篩，或者粉碎成普通粗粉即可（購買藥材時可直接要求粉碎），粉碎過細(xì)容易導(dǎo)致抽濾困難，延長試驗時間。

3.3提取工藝

比較了甲醇回流、甲醇超聲和0.5%鹽酸水溶液滲濾（常規(guī)生物堿提取方法［19-20］）3種提取方法。結(jié)果表明甲醇回流提取成分復(fù)雜，后續(xù)分離困難，而0.5%鹽酸水溶液滲濾對荷包牡丹堿的提取率很低。所以實驗教學(xué)中采用甲醇超聲提取最佳，既能較完全地提取荷包牡丹堿，而且引入的雜質(zhì)少，有利于后續(xù)分離。

3.4柱層析洗脫劑篩選

二乙胺可以極大增加洗脫劑對荷包牡丹堿的洗脫能力。所以實驗教學(xué)中應(yīng)注意，第1次洗脫不加二乙胺，可以洗脫大部分雜質(zhì)，而不會洗脫荷包牡丹堿。第2次洗脫須加入二乙胺，增強對荷包牡丹堿的洗脫能力，可以集中得到純度高于80%的荷包牡丹堿。此部分會混有少量極性更大的青藤堿。

3.5重結(jié)晶甲醇用量

在保證溶解的情況下，重結(jié)晶溶劑甲醇的用量應(yīng)該盡量少，可以采用加熱幫助溶解，這樣可以實現(xiàn)高純度（大于90%）、高收率的獲得荷包牡丹堿。

4　實驗教學(xué)心得

荷包牡丹堿的分離純化實驗具有容易操作、試劑簡單和結(jié)果可控的優(yōu)點，并于去年應(yīng)用于云南大學(xué)化學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院制藥工程專業(yè)的實驗教學(xué)中，取得了良好的教學(xué)效果。本實驗要求學(xué)生查閱相關(guān)文獻，了解生物堿的常規(guī)提取方法和硅膠柱層析洗脫條件選擇的原則。在實驗過程中讓學(xué)生熟悉了天然藥物化學(xué)的基本操作，包括提取、柱層析和重結(jié)晶等。在實驗報告的撰寫過程中，要求學(xué)生思考實驗中遇到的問題，比如抽濾困難與粉碎過細(xì)有關(guān)，提取效率低又和粉碎粒度、提取時間和溶劑加入量有關(guān)等，結(jié)合實驗過程能夠讓學(xué)生更好地掌握天然藥物化學(xué)實驗的基本操作和實驗原理。

綜上所述，荷包牡丹堿的分離純化實驗適用于制藥工程專業(yè)天然藥物化學(xué)的實驗教學(xué)。

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A new teaching experiment that the design of isolation and purification of dicentrine in our school

WEIKunCAILe LIU JinZHOU Hao CAO Qiu′e
School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Yunnan Province，Kunming650091，China

Chemistry of natural medicine is an important compulsory course for pharmaceutical specialty and the corresponding experiment course is also very important.A new teaching experiment for chemistry of natural medicine—isolation and purification of dicentrine is developed in School of Chemical Science and Technology，Yunnan University. In this experiment，pure dicentrine can be obtained from Stephania epigaea according to methanol ultrasonic extraction，silica gel column chromatography，and methanol recrystallization.This experiment is convenient，effective，and suitable to be a teaching experiment for the undergraduate of pharmaceutical engineering.

Dicentrine；Extraction and purification；Chemistry of natural medicine；Pharmaceutical engineering

G642.0

A

1673-7210（2016）01（b）-0167-03

2015-10-13本文編輯：程銘）

云南省高校本科教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項目（2013）。

蔡樂（1977-），男，博士，副教授；研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。