盧曉華，鄒軍輝，鄭　威，楊建設(shè)，王　蒲△（.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所，廣東深圳58055）

LIGHT作為EBNA1 DNA疫苗佐劑的免疫效應(yīng)研究

盧曉華1，2，鄒軍輝2，鄭威2，楊建設(shè)1，王蒲2△（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所，廣東深圳518055）

目的研究LIGHT作為免疫佐劑在EB病毒核抗原1（EBNA1）DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中的作用。方法以Balb/c小鼠肝臟cDNA為模板，PCR擴(kuò)增構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-LIGHT；轉(zhuǎn)染細(xì)胞，驗(yàn)證LIGHT蛋白的表達(dá)；采用電脈沖方法，以LIGHT質(zhì)粒為佐劑與EBV DNA疫苗聯(lián)合免疫小鼠，測(cè)定血清中EBNA1特異性抗體；分離和收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，經(jīng)EBNA1抗原刺激后，測(cè)定細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）的分泌水平。結(jié)果PCR擴(kuò)增出LIGHT目的片段，大小為720 bp；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）鑒定結(jié)果：在蛋白Marker相對(duì)分子質(zhì)量26×103上方有單一清晰目的條帶，表明有LIGHT蛋白表達(dá)；免疫小鼠血清測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：LIGHT聯(lián)合DNA疫苗實(shí)驗(yàn)組的抗體滴度是單獨(dú)DNA疫苗免疫組的3倍；脾淋巴細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果表明LIGHT聯(lián)合免疫組能明顯增強(qiáng)IFN-γ的分泌。結(jié)論LIGHT作為免疫佐劑，可依賴(lài)其介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)抗體的產(chǎn)生和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌具有顯著促進(jìn)作用。

皰疹病毒4型，人；疫苗，DNA；佐劑，免疫；LIGHT；電脈沖免疫

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種人類(lèi)γ皰疹病毒，在人群中感染非常普遍［1］，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌等［2］。EB病毒核抗原1（EBNA1）是EBV感染人體后編碼表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，是EBV DNA復(fù)制、病毒基因維持終生感染和B淋巴細(xì)胞永生化過(guò)程中唯一必需的病毒蛋白［3-4］。DNA疫苗將編碼EBNA1的基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體，再直接導(dǎo)入機(jī)體，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了提高DNA疫苗的免疫原性和免疫效果，一方面在疫苗中加入佐劑聯(lián)合免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答水平［5-6］；另一方面采用電脈沖（electric pulse，EP）介導(dǎo)的免疫方法［7-9］，提升DNA疫苗的表達(dá)水平，從而提高疫苗的免疫原性［7］。LIGHT屬于腫瘤壞死因子超家族成員（TNFSF14）［10-11］，是一種非CD28依賴(lài)的共刺激分子；LIGHT與其功能受體結(jié)合介導(dǎo)的LIGHT-HVEM/LTβR信號(hào)通路，通過(guò)刺激T細(xì)胞活化和增殖［12］及誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡［13］，在抗病毒感染免疫中發(fā)揮重要作用［14-15］。本研究以LIGHT質(zhì)粒DNA作為EBNA1 DNA疫苗的佐劑，通過(guò)LIGHT的表達(dá)增強(qiáng)EBNA1特異性抗體的產(chǎn)生和T淋巴細(xì)胞活化，有效增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效應(yīng)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇雌性Balb/c小鼠24只，年齡6～8周，無(wú)特定病原體級(jí)（SPF級(jí)），購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2菌株與試劑大腸埃希菌DH5α及質(zhì)粒pcD-NA3.1（+）和質(zhì)粒pcDNA3.1-EBNA1為本實(shí)驗(yàn)室保存，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶購(gòu)自Takara公司，DNA Marker、蛋白Maker、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1LIGHT全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增根據(jù)LIGHT全長(zhǎng)序列（239個(gè)氨基酸），利用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物L(fēng)IGHT-F：5′CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGAGTGTGGTACAGCC 3′、下游引物L(fēng)IGHTR：5′GGAATTCGACCATGAAAGCTCCGAAAT 3′；其中上游引物和下游引物分別添加HindⅢ和EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)，引物均由Invitrogen公司合成。從Balb/c小鼠肝臟組織中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；再以cDNA為模板，利用LIGHT特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以小鼠肝臟cDNA為模板，擴(kuò)增LIGHT膜外區(qū)全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系（100 μL）：5×Buffer 20 μL、dNTP mix 8 μL、DNA 6 μL、LA Taq酶1 μL、引物混合物4 μL、雙蒸水61μL；反應(yīng)參數(shù)為：95℃2min，95℃15s，68℃15s，72℃3 min，共35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸8 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2LIGHT重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將1.2.1項(xiàng)回收的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒，利用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別進(jìn)行酶切反應(yīng)，再分別進(jìn)行酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳回收，然后分別將回收的酶切產(chǎn)物L(fēng)IGHT以摩爾比6∶1的比例與pcDNA3.1（+）酶切產(chǎn)物混合，加入T4 DNA連接酶，22℃連接1 h，進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，然后用含氨芐青霉素抗性的平板篩選陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性單克隆經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，送Invitrogen公司測(cè)序鑒定，最后大量抽提無(wú)內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒。

1.2.3LIGHT蛋白的表達(dá)和鑒定將無(wú)內(nèi)毒素pcDNA-LIGHT質(zhì)粒利用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到生長(zhǎng)密度已達(dá)80%的人源胚胎腎細(xì)胞（HEK）293 T細(xì)胞，在5%CO2、37℃條件下用10%胎牛血清（FBS）DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，分離和收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）分析并鑒定293 T細(xì)胞中LIGHT蛋白表達(dá)水平。

1.2.4電脈沖免疫方法和動(dòng)物免疫SPF級(jí)Balb/c小鼠，隨機(jī)分為四組（6只/組），先分別肌內(nèi)注射EBNA1質(zhì)粒DNA疫苗和LIGHT質(zhì)粒佐劑混合液，每只每次劑量為50 μg；再利用NEPA GENE動(dòng)物電轉(zhuǎn)儀，在電壓80 V、脈沖次數(shù)6次、脈沖間隔25 ms、頻率2 Hz條件下電轉(zhuǎn)刺激；于第0、2、4、6周觀察免疫反應(yīng)，第7周處死Balb/c小鼠，檢測(cè)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。

1.2.5免疫小鼠血清分離和抗體滴度的檢測(cè)

1.2.5.1血清制備分別在3、5、7周于Balb/c小鼠眼眶取血約100 μL，血樣室溫靜置1 h，離心分離血清，血清樣品保存于-20℃待測(cè)。

1.2.5.2血清中EBNA1抗體滴度的檢測(cè)首先將原核表達(dá)純化的EBNA1蛋白包被于微孔板，經(jīng)封閉和洗滌后；將分離的血清倍比稀釋分別加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔，37℃孵育；再經(jīng)洗滌步驟后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，依次經(jīng)過(guò)孵育和洗滌步驟后；加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液，孵育3 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，于450 nm測(cè)定吸光度值。將免疫小鼠第3、5周的血清收集和分離后，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清中EBNA1特異性抗體滴度。

1.2.6小鼠脾細(xì)胞懸液制備和細(xì)胞因子的檢測(cè)

1.2.6.1小鼠淋巴細(xì)胞的制備（1）處死免疫的小鼠后，于75%乙醇中浸泡消毒，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)進(jìn)行操作；無(wú)菌條件下取出小鼠脾臟，置于DMEN無(wú)血清培養(yǎng)基中，研磨分散脾細(xì)胞，離心，棄上清液；（2）加入4℃預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液（Tris1.3g，NH4Cl3.55g，定容至500mL，調(diào)節(jié)pH至7.2，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆茫?，裂解后，離心，棄上清液；（3）加入無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次后，離心，棄上清液，再用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻；（4）在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照所得細(xì)胞數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1×107個(gè)；（5）最后每孔加入50μL制備的淋巴細(xì)胞，總體積200 μL（每孔細(xì)胞總數(shù)為5× 105個(gè)）；實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為1μg/mL的EBNA1蛋白（陽(yáng)性對(duì)照不加蛋白），加入終濃度為1 μg/mL的ConA，陰性對(duì)照不加蛋白，然后加完全培養(yǎng)液。置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。

1.2.6.2細(xì)胞因子IFN-γ的檢測(cè)將分離的細(xì)胞培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照IFN-γ檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞表達(dá)分泌IFN-γ水平。

2　結(jié)　果

2.1LIGHT編碼區(qū)全長(zhǎng)基因的克隆及重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)720 bp大小的LIGHT片段（圖1）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LIGHT。LIGHT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α和篩選后，菌落PCR和雙酶切鑒定結(jié)果（圖2）顯示，雙酶切后的質(zhì)粒在720 bp處有明顯目的條帶；質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明pcDNA3.1-LIGHT載體構(gòu)建成功。

圖1　PCR擴(kuò)增LIGHT目的片段

圖2　LIGHT重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.2LIGHT真核載體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)

LIGHT編碼區(qū)全長(zhǎng)基因編碼239個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26 340（單體且未糖基化時(shí)）。LIGHT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，在蛋白Marker 26×103上方附近處顯示單一清晰條帶，與LIGHT的預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量26 340相符；LIGHT真核表達(dá)載體在293T細(xì)胞中正確表達(dá)，且所表達(dá)的目的蛋白具有很好的免疫原性。見(jiàn)圖3。

圖3　LIGHT真核載體的表達(dá)鑒定

2.3LIGHT佐劑對(duì)EBNA1 DNA疫苗特異性抗體滴度的影響ELISA測(cè)定結(jié)果顯示，單獨(dú)的EBNA1 DNA疫苗能夠產(chǎn)生特異性抗體，滴度達(dá)4.5×104，而加入LIGHT佐劑的DNA疫苗較單獨(dú)的疫苗，其EBNA1特異性抗體滴度高2.6倍，抗體滴度達(dá)1.16×105，說(shuō)明LIGHT佐劑能夠增強(qiáng)DNA疫苗體液免疫應(yīng)答。見(jiàn)圖4。

2.4LIGHT佐劑對(duì)DNA疫苗細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響

免疫周期的第5周，將Balb/c小鼠處死，在無(wú)菌條件下分離脾淋巴細(xì)胞，以EBNA1蛋白作為特異性抗原刺激、ConA為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定DNA疫苗細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng)，同時(shí)也分析LIGHT佐劑的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。淋巴細(xì)胞經(jīng)EBNA1蛋白刺激后，重組DNA疫苗免疫小鼠的淋巴細(xì)胞較陰性對(duì)照組具有更強(qiáng)分泌IFN-γ的能力，混合LIGHT佐劑的EBNA1DNA疫苗免疫組（LIGHT+EBNA1），其細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平較EBNA1蛋白刺激免疫組提高1倍，也證實(shí)了LIGHT佐劑混合重組EBV DNA疫苗能提高疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)能力。見(jiàn)圖5。

圖4　不同免疫小鼠血清EBNA1特異性抗體滴度測(cè)定情況

圖5　各組免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平測(cè)定情況

3　討　論

EBV作為一種致瘤病毒，由于其感染的廣泛性和普遍性，迫切需求EB病毒疫苗的研發(fā)，目前已初步研究出多種疫苗［12，16-17］；選擇更好的靶點(diǎn)、免疫方式和免疫佐劑，以最大限度地阻斷EB病毒感染和殺傷感染細(xì)胞是EBV疫苗研究的發(fā)展方向。

DNA疫苗由于其易于改造、可塑性強(qiáng)、生產(chǎn)便捷、穩(wěn)定性好、安全性高、運(yùn)輸方便，以及不僅能誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答，還能增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注；在病毒性疾病和自身免疫性疾病等領(lǐng)域已經(jīng)取得重大進(jìn)展，并已有疫苗獲批上市。免疫原性和有效性是DNA疫苗研發(fā)的重點(diǎn)和難度，在疫苗發(fā)揮免疫效應(yīng)過(guò)程中，抗原提呈細(xì)胞（特別是樹(shù)突狀細(xì)胞）扮演著重要角色；因此，從促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞功能角度出發(fā)，是提高DNA疫苗免疫效應(yīng)的可行策略。

LIGHT與其功能性受體LTβR和HVEM結(jié)合［11，13，18］所介導(dǎo)的信號(hào)通路是樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的維持和遷移的重要基礎(chǔ)，能夠誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟［19-20］，促進(jìn)其抗原提呈能力，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答［5，14］（包括刺激T細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞因子IFN-γ的分泌）；此外，LIGHT還可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化及特異性IgG 和IgM的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答［14］。

電脈沖免疫方法［21］是利用電脈沖的作用首先在細(xì)胞質(zhì)膜上形成親水性的孔，增加質(zhì)膜的通透性，以便于質(zhì)粒DNA借助電泳作用進(jìn)入細(xì)胞。有研究表明，電脈沖免疫法能夠顯著提高DNA進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量，從而提高質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率；進(jìn)而增加目的蛋白的表達(dá)，有研究表明，電脈沖免疫方法比純DNA注射，其目的蛋白表達(dá)增加100～1 000倍［7］，有效增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性，表現(xiàn)為高抗體滴度和特異性T細(xì)胞應(yīng)答增加。

本研究結(jié)果也證實(shí)了混合LIGHT的EBNA1 DNA疫苗所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答均顯著高于單獨(dú)的EBNA1DNA疫苗。因此，LIGHT有望成為EBNA1 DNA疫苗的免疫佐劑，為開(kāi)發(fā)EBV相關(guān)腫瘤和疾病的治療性疫苗奠定基礎(chǔ)。

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Study on immune effect of LIGHT as adjuvant of EBNA1 DNA vaccine

Lu Xiaohua1，2，Zou Junhui2，Zheng Wei2，Yang Jian-

she1，WangPu2△（1.CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou，Gansu730070，China；2.InstituteofBiomedicine and Biotechnology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen，Guangdong 518055，China）

ObjectiveTo study the effect of LIGHT as an adjuvant in the immune responses induced by EB viral nuclear antigen1（EBNA1）DNA vaccine.MethodsThe liver cDNA of Balbc/c mouse served as the template.The eukaryotic expression vector pcDDNA3.1-LIGHT was constructed by PCR amplification；the cell transfection was conducted，the LIGHT protein expression was verified；by adopting the electric pulse method，the mouse was immunized with the LIGHT plasmid as the adjuvant combined with EBV DNA vaccine.The specific antibody of serum EBNA1 was detected.The mouse spleen lymphocytes were separated and collected.After stimulation by EBNA1 antigen，cytokine IFN-γ secretion level was detected.ResultsThe LIGHT target fragment was amplified by PCR，which was about 720 bp，the Western blot identification results showed that a single clear target band was above 26×103，demonstrating that LIGHT protein was expressed；the serum detection results in the immune mouse showed that the antibody titer in the LIGHT combined DNA vaccine experimental group was 3 times of that in the single DNA vaccine immune group；the spleen lymphocyte factor detection results showed that the LIGHT combined immune group could significantly increase the IFN-γ secretion.ConclusionLIGHT as the adjuvant has significant promoting effect in the generation of antibody and secretion of related cytokines by depending on its mediated signal pathway.

Herpesvirus 4，human；Vaccines，DNA；Adjuvants，immunologic；LIGHT；Electroporation

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.11.006

A

1009-5519（2016）11-1618-04

盧曉華（1990-），碩士研究生，主要從事病毒疫苗的研究。
△

，E-mail：pu.wang@siat.ac.cn。

（2016-02-21）