高志榮，李學(xué)晉（1.臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江臺(tái)州18000；2.臺(tái)州學(xué)院附屬市立醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江臺(tái)州18000；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)45000）

熱休克蛋白60對(duì)急性胰腺炎發(fā)病的影響*

高志榮1，2，李學(xué)晉3
（1.臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江臺(tái)州318000；2.臺(tái)州學(xué)院附屬市立醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江臺(tái)州318000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000）

目的探討熱休克蛋白60（HSP60）對(duì)急性胰腺炎的影響。方法在急性胰腺炎模型復(fù)制成功后1、5、10 h，分別收集胰腺組織和血清，采用real time-PCR法測定胰腺組織中HSP60 mRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測定血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果在模型復(fù)制成功后1、5、10 h，胰腺組織HSP60 mRNA的表達(dá)水平呈明顯下降趨勢（P＜0.05），大鼠血清中TNF-α水平呈明顯上升趨勢（P＜0.05）。結(jié)論在急性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展過程中，胰腺組織HSP60表達(dá)逐漸下降，而胰腺組織的損傷程度逐漸加重，HSP60的低表達(dá)可能會(huì)增加急性胰腺炎的嚴(yán)重程度。

胰腺炎；急性病；熱休克蛋白質(zhì)類；腫瘤壞死因子α；胰腺

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上危急重癥較難治療的疾病之一，且對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究有100多年歷史，關(guān)于AP發(fā)病機(jī)制的假說包括胰腺自身消化學(xué)說、胰腺微循環(huán)障礙學(xué)說、胰腺腺泡細(xì)胞鈣超載學(xué)說、氧自由基損傷學(xué)說、炎癥介質(zhì)-細(xì)胞因子損傷學(xué)說等，其中胰腺自身消化學(xué)說比較經(jīng)典［1-3］。然而，胰腺腺泡細(xì)胞酶原激活與熱休克蛋白60（heatshock protein 60，HSP60）的相互作用情況及對(duì)AP發(fā)病的影響尚未明確闡明［4-5］。本文作者就HSP60在AP發(fā)病中的作用進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，購自復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1AP模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)前將SD大鼠于（25±2）℃、（55±5）%濕度環(huán)境下喂養(yǎng)，給予實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)食物和水。AP大鼠模型復(fù)制方法參照文獻(xiàn)［6］，即受試SD大鼠于術(shù)前禁食、禁飲12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/kg）麻醉后，取上腹正中切口，暴露腹腔，在近肝門處用動(dòng)脈夾夾閉膽總管，經(jīng)胰膽管十二指腸開口處緩慢進(jìn)針，以0.2 mL/min速度靜脈注射3%去氧膽酸鈉（1 mL/kg體質(zhì)量），且注射后先壓迫進(jìn)針點(diǎn)，然后再解除膽管阻斷，關(guān)閉腹腔。將40只大鼠隨機(jī)分為兩組，各20只，一組為假手術(shù)組（Sham組），另一組為AP模型組（AP組）。Sham組不給予去氧膽酸鈉注射，其余操作方法與AP組相同。AP造模后1、5、10 h，在麻醉下分別取兩組SD大鼠血液，離心取上清液，并各取其胰腺組織。

1.2.2real time-PCR法檢測胰腺組織HSP60 mRNA表達(dá)胰腺組織HSP60 mRNA表達(dá)檢測參照Li等［6］方法。采用Trizol試劑（TaKaRa公司）從胰腺組織塊中提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用PCR儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s；95℃5 s，60℃31 s，45個(gè)循環(huán)。

1.2.3血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的檢測采用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（Sigma公司）進(jìn)行檢測，按照說明書介紹的方法操作，即在酶標(biāo)板每孔中各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后于37℃放置120min，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干，每孔中加入一抗工作液100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后于37℃放置60 min，再次同上述洗板，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將反應(yīng)板于37℃放置30 min，第3次洗板，每孔加入底物工作液100 μL，于37℃暗處反應(yīng)15 min，每孔加入100 μL終止液混勻，在30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，所有光密度（OD）值均應(yīng)減去空白OD值后再進(jìn)行計(jì)算，以標(biāo)準(zhǔn)品2 000.0、1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、0.0pg/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上找出相應(yīng)TNF-α含量，結(jié)果以“pg”為單位。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1胰腺組織HSP60 mRNA表達(dá)量比較AP造模后1 h，胰腺組織HSP60 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較高，在隨后5、10 h時(shí)間點(diǎn)上，胰腺組織HSP60 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈下調(diào)趨勢（P＜0.05）；在1 h時(shí)，與Sham組比較，HSP60 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在5 h時(shí)，與Sham組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在10 h時(shí)，AP組HSP60 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較Sham組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　胰腺組織HSP60 mRNA的復(fù)制AP模型后相對(duì)表達(dá)量比較（±s，%）

表1　胰腺組織HSP60 mRNA的復(fù)制AP模型后相對(duì)表達(dá)量比較（±s，%）

注：與Sham組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與1 h AP組比較，bP＜0.05。

組別S h a m 組A P 組1 h 　5 h 　1 0 h 2 . 0 3 ± 0 . 3 7 4 . 3 5 ± 0 . 5 4a2 . 6 1 ± 0 . 4 8 2 . 8 2 ± 0 . 3 3b2 . 3 6 ± 0 . 4 2 1 . 3 2 ± 0 . 5 5ab

2.2AP大鼠血清中TNF-α的變化復(fù)制AP模型后1、5、10 h時(shí)間點(diǎn)上，大鼠血清中TNF-α呈明顯升高趨勢（P＜0.05）；在1 h時(shí)，與Sham組血清中TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但在5、10 h時(shí)，AP組血清中TNF-α的含量較Sham組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　大鼠血清中TNF-α表達(dá)情況比較（±s，pg/mL）

表2　大鼠血清中TNF-α表達(dá)情況比較（±s，pg/mL）

注：與Sham組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與1 h AP組比較，bP＜0.05。

組別S h a m 組A P 組1 h 　5 h 　1 0 h 8 6 . 0 0 ± 6 . 5 3 8 8 . 0 0 ± 5 . 7 2 9 9 . 0 0 ± 7 . 4 4 1 7 6 . 0 0 ± 6 . 9 0ab1 0 6 . 0 0 ± 7 . 8 2 2 0 2 . 0 0 ± 6 . 5 7ab

3　討　論

AP發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有許多因素及環(huán)節(jié)參與其中，包括胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶激活、缺血、鈣超載、氧自由基、炎癥介質(zhì)-細(xì)胞因子等。AP的發(fā)生、發(fā)展一般分為3個(gè)階段：觸發(fā)階段（啟動(dòng)階段）、早期胰腺腺泡細(xì)胞事件階段、晚期胰腺腺泡細(xì)胞和非胰腺腺泡細(xì)胞事件階段。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AP的早期胰腺腺泡細(xì)胞事件是其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而早期胰腺腺泡細(xì)胞事件的關(guān)鍵是胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶過早激活［7-8］。然而，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶過早激活的機(jī)制及早期胰腺腺泡細(xì)胞的可能事件還不十分清楚。

HSP60作為一種分子伴侶存在于所有原核及真核生物某些細(xì)胞器中，如線粒體。其重要的生物功能日益引起人們的重視，尤其是細(xì)胞保護(hù)作用。其在正常細(xì)胞中表達(dá)量極低，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激條件下（如休克、感染、高溫、缺氧、創(chuàng)傷等）HSP60表達(dá)量明顯升高，以提高細(xì)胞耐受應(yīng)激的能力［9-14］。胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶的分布特點(diǎn)與HSP60相似，從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至酶原顆粒，最后胰酶釋放。本研究結(jié)果顯示，胰腺組織中HSP60 mRNA在AP模型后1 h表達(dá)水平明顯增高，可認(rèn)為在應(yīng)激條件下胰腺腺泡細(xì)胞的反應(yīng)，對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞起到保護(hù)作用；然而HSP60 mRNA的表達(dá)量在AP模型后5、10 h持續(xù)顯著下降，可能是胰腺組織受到較為嚴(yán)重的損傷導(dǎo)致胰腺組織活力下降，從而造成其合成減少。原因是作者可在AP模型后5、10 h觀察到血清中TNF-α水平明顯升高，而其在AP模型后1 h表達(dá)水平并未明顯升高；然而，也有學(xué)者認(rèn)為強(qiáng)刺激致HSP60表達(dá)水平減少也可能是AP發(fā)生的因素之一。由此，作者推測，胰腺組織HSP60表達(dá)水平升高可提高胰腺組織對(duì)損傷因子的保護(hù)作用，在AP發(fā)生、發(fā)展過程中，胰腺組織HSP60的表達(dá)水平減少可能與胰腺腺泡內(nèi)胰酶過早激活有關(guān)，胰酶與HSP60二者失衡可能是促使AP發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一，從而證實(shí)HSP60對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用，在臨床上是否可以通過HSP60的高表達(dá)來減少胰腺組織的損傷，至于后續(xù)研究將進(jìn)一步觀察HSP60如何參與胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的過早激活。

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Influence of heat shock protein 60 on onset of acute pancreatitis*

Gao Zhirong1，2，Li Xuejin3（School of Medicine，Taizhou College，Taizhou，Zhejiang 318000，China；2.Department of Gastroenterology，Affiliated Municipal Hospital，Taizhou College，Taizhou，Zhejiang 318000，China，China；3.Sanquan College，Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan 453000，China）

ObjectiveTo explore the influence of heat shock protein 60（HSP60）on acute pancreatitis（AP）.Methods The pancreatic tissue and serum were collected at 1，5，10 h after successfully copying AP model，respectively.The real time PCR was adopted to detect the expression of HSP60 in pancreatic tissue；the ELISA method was used to detect the level of serum TNF-α.ResultsThe expression of pancreatic tissue HSP60 mRNA at 1，5，10 h after successfully copying AP model showed the obvious downward trend（P＜0.05），the serum TNF-α level in rat demonstrated significantly increasing trend（P＜0.05）.ConclusionIn the process of the occurrence and progression of AP，the expression of pancreatic tissue HSP60 expression is gradually declined，and the injury degree of pancreatic tissue is much more severer，low expression of HSP60 may increase the severity of acute pancreatitis.

Pancreatitis；Acute disease；Heat-shock proteins；Tumor necrosis factor-alpha；Pancreas

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.003

A

1009-5519（2016）04-0487-02

浙江省臺(tái)州市科技局資助項(xiàng)目（2011ky1101）。

高志榮（1978-），博士研究生，講師，主要從事消化系統(tǒng)疾病的研究。

（2015-11-20）