朱俊輝，王軍政，王一鳴，趙艷麗，王開，陳小慶，胡桂學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

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胰酶對豬流行性腹瀉病毒纖突蛋白作用的研究進展

朱俊輝，王軍政，王一鳴，趙艷麗，王開，陳小慶，胡桂學(xué)*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的分離及纖突(S)蛋白是最近幾年研究的熱點。結(jié)合胰酶對PEDV S蛋白裂解作用促進病毒分離的國際最新研究進展，并對S蛋白及其功能、胰酶改變S蛋白構(gòu)象、胰酶觸發(fā)S蛋白融合機制等方面進行綜述，以期為PEDV的防控提供參考。

豬流行性腹瀉病毒；分離；胰酶；S蛋白

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床癥狀，最終破壞電解質(zhì)平衡導(dǎo)致病豬死亡的的一種急性腹瀉病[1]。PEDV屬套式病毒目，冠狀病毒屬，有囊膜，囊膜上包裹著花瓣狀的纖突。其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，大小在28～30 kb，由七個開放閱讀框(ORF)編碼三個非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3),四個結(jié)構(gòu)蛋白：S蛋白(纖突蛋白)、E蛋白(小膜蛋白)、M蛋白(膜糖蛋白)和N蛋白(核蛋白)。其中，S蛋白在病毒的融合機制、組織嗜性和致病性等多方面發(fā)揮重要作用。然而本次流行毒株S基因多引入9個堿基的變異，致使新型毒株大范圍流行，對于PED新毒株的分離,再次成為焦點問題。目前，研究發(fā)現(xiàn)胰酶在PEDV分離中被廣泛應(yīng)用，因為胰酶可裂解 S蛋白，使其在體外感染Vero細胞，并且隨著胰酶的濃度增加PEDV感染效果越明顯[2]。而胰酶在PEDV分離中與S蛋白的作用機制仍然不是很清晰，本文將通過介紹胰酶對S蛋白作用的最新研究進展，為以后新型PEDV分離和疫苗研究提供參考。

1 PEDV的變異及傳播

1971年P(guān)ED首次在英國報道，隨后遍及歐洲和亞洲各國。2010年以后PEDV S 基因S1區(qū)N端堿基出現(xiàn)15個堿基插入和6個堿基缺失，比對發(fā)現(xiàn)這些突變區(qū)堿基多為T和C的互相轉(zhuǎn)換。該毒株隨后流行于中國、韓國、泰國和日本等國家。然而，現(xiàn)有疫苗株CV777與其同源性為96.9%，導(dǎo)致疫苗防治無效[3]。2013年美國23個州爆發(fā)疫情，2014年德國報道PED的流行，且流行毒株與變異毒株同源性更高[4-5]。PEDV變異毒株的出現(xiàn)，導(dǎo)致大量仔豬的死亡，使其成為業(yè)界關(guān)注的熱點。PEDV的變異很可能與冠狀病毒的 S 蛋白進化性有很大聯(lián)系，是冠狀病毒適應(yīng)新環(huán)境所產(chǎn)生的進化。同為冠狀病毒的豬傳染性胃腸炎病毒PRCV-ISU-1株也在 S 蛋白的N端有227氨基酸的缺失，從而改變了該病毒的組織嗜性[6]。Gao等發(fā)現(xiàn)流行我國華東和華北的流行毒株與與韓國毒株更相似，而南方地區(qū)的毒株又與泰國流行毒株關(guān)系更近[7]。泰國學(xué)者也曾分析發(fā)現(xiàn)，新型PEDV爆發(fā)的很大原因來自豬肉和骨粉等原料的進口，從而使病毒在泰國傳播[8]。同樣在美國爆發(fā)疫情后，墨西哥和加拿大也隨即出現(xiàn)該病的報道，因此這種地緣位置和經(jīng)濟貿(mào)易，可能是該病傳播的重要途徑。

2 S蛋白及其功能

S蛋白也稱纖突蛋白，即Ⅰ類冠狀病毒融合蛋白，主要負責(zé)病毒的吸附和融合。S蛋白由4152個核苷酸編碼1383個氨基酸組成，被分成N端S1區(qū)(1～789氨基酸)和C端S2區(qū)(790～1383氨基酸)，S1區(qū)主要作為受體，S2是膜融合的功能區(qū)[9-10]。S2區(qū)又分為三個亞區(qū)，包括胞外區(qū)、跨膜固定區(qū)(TM)、胞質(zhì)尾區(qū)(CT)。胞外區(qū)有胰酶切割位點，S1和S2共同作用促進PEDV感染細胞，而這個感染過程需要在胰酶的輔助下完成。S 基因的胞外區(qū)也是病毒粒子的毒力基因，然而近幾年世界流行的毒株幾乎全部在S基因N端170～171 bp位點插入CAGGGTGTCAAT和413～414 bp插入ATA共計15個堿基并在479～480 bp缺失TGGGGAA。通過比對發(fā)現(xiàn)S基因有198個左右核苷酸發(fā)生突變，其中發(fā)生在S1區(qū)內(nèi)突變占73.3%。Sun R等學(xué)者將2010-2012年我國分離到PEDV流行株的S基因與2010年以前的毒株進行序列比對，發(fā)現(xiàn)新分離的毒株在S基因也在相同位點發(fā)生了15個堿基的插入和6個堿基的缺失。這種變化可能潛在的改變了PEDV S基因抗原性，因為PEDV抗原中和表位(COE 499-638 aa)存在S基因內(nèi)[11]。日本學(xué)者報道過的83p-5毒株在傳代的過程中，發(fā)現(xiàn)34代和61代出現(xiàn)的18個堿基變化在100代仍存在，致使83p-5株S蛋白信號肽、S1和S2的膜外區(qū)發(fā)生突變，導(dǎo)致該毒株對仔豬致病性減弱[12]。綜上可知，病毒毒力的改變和S基因上的堿基變化有很大聯(lián)系。而近年流行的變異毒株與疫苗CV777株相比，在S基因N端共計多出9個堿基的變化，使S 蛋白上的糖基化位點、毒力基因、細胞培養(yǎng)特性和跨膜螺旋都發(fā)生了變化[13]。因此S 基因的變異情況更能體現(xiàn)PEDV的整體變化情況。

S蛋白作為Ⅰ類融合蛋白在感染過程中尤為重要，它是冠狀病毒膜融合進入細胞的功能蛋白，S蛋白經(jīng)胰酶等處理，可轉(zhuǎn)變?yōu)槟と诤系鞍譡14]。通過胰酶裂解的S 蛋白易發(fā)生構(gòu)象改變促進膜融合。我國學(xué)者使用LJB/03毒株對豬氨基肽酶N(pAPN)轉(zhuǎn)染到MDCK細胞中表達，發(fā)現(xiàn)S 蛋白能與豬小腸上的pAPN發(fā)生受體結(jié)合，并證實pAPN為PEDV的感染性受體[15]。這個結(jié)合過程很可能是胰酶把S蛋白裂解成S1和S2兩個結(jié)構(gòu)域，S1識別細胞表面受體pAPN，激活信號肽上的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，S2區(qū)在刺激下執(zhí)行S蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)化與細胞膜發(fā)生融合[16]。但是pAPN受體是不存在Vero細胞上的， 所以很可能PEDV感染細胞不只是通過這一種途徑或者有不同的功能性受體。2010年以后由于S 基因共計9個堿基在S1區(qū)的插入，可能潛在的改變了PEDV對細胞的適應(yīng)性和胰酶促進PEDV融合的位點。

3 胰酶對 S蛋白的作用

3.1 胰酶改變S蛋白構(gòu)象 PEDV S蛋白具有Ⅰ類融合蛋白所具有的共同特征包括融合蛋白N端相同的融合肽位點和C端以螺旋形式包圍的三螺旋結(jié)構(gòu)，從而使S蛋白形成一種亞穩(wěn)的三聚體形式存在。病毒的這種結(jié)構(gòu)，在特定因素的刺激下就會與受體發(fā)生融合[17]。因此大多數(shù)病毒的分離都需要借助胰酶的作用，例如禽流感病毒、人冠狀病毒229E(HCoV-229E)、非典型肺炎(SARS-CoV)、鼠肝炎病毒(MHV)和PEDV等[18-19]。Kazuya等報道PEDV在體外感染Vero細胞時只有存在胰酶樣物才能形成多核體，促進細胞間融合[20]。而在缺少外源蛋白酶的情況下，PEDV也可通過胞內(nèi)體途徑并利用內(nèi)源組織蛋白酶激活S蛋白進行膜融合。冠狀病毒一般利用S蛋白的融合作用進入細胞，通過囊膜與細胞膜融合和胞吞兩種途徑。然而病毒感染細胞過程是需要利用胰酶改變S蛋白的構(gòu)象促進病毒與細胞發(fā)生融合。首先病毒上的融合蛋白誘導(dǎo)病毒與靶細胞的融合，結(jié)合作用后暴露融合肽使靶膜與細胞膜緊密接觸，這時融合肽周圍的脂質(zhì)分子進行重排，最后通過中間體過度發(fā)生融合。而胞吞機制被認為是pH敏感的過程，但是直接的膜融合是不依賴pH值[17,21-22]。研究證明HCoV-229E 通過胰酶和組織蛋白酶L的裂解后，可有效的促進膜融合 ，這種感染過程與SARS-CoV侵入細胞是有共同特征的[23]。Matsuyama證實冠狀病毒的 S 蛋白經(jīng)過兩次構(gòu)象的變化，并在胰酶介導(dǎo)下可發(fā)生膜融合。通常是因為S蛋白含有特征性的保守七肽重復(fù)區(qū)(HR),包括HR-C和HR-N。病毒在融合過程中HR-N常形成一個內(nèi)部的三聚體卷曲螺旋結(jié)構(gòu)與三個HR-Cs以反并聯(lián)的方式結(jié)合，最終形成六螺旋體(6HB)，這種結(jié)構(gòu)易與細胞膜貼近利于膜融合的發(fā)生[24]。最新研究顯示，發(fā)現(xiàn)真實的六螺旋體直接在細胞膜上耦合形成，更加暗示著通過六螺旋體的結(jié)構(gòu)促進病毒與細胞的融合[25-27]。PEDV融合機制完全與同類冠狀病毒感染的過程是相同的，它們都是通過胰酶作用改變S蛋白結(jié)構(gòu)，使病毒形成易于融合的六螺旋體結(jié)構(gòu)，促進病毒感染[14]。

3.2 胰酶觸發(fā)S蛋白的融合機制 冠狀病毒是囊膜病毒，它的融合過程可利用多種途徑。例如在受體結(jié)合后可利用酸性環(huán)境或胰酶水解激活S蛋白，從而使融合肽與靶膜融合，這個過程都是由S蛋白調(diào)控的[28]。Judith等學(xué)者根據(jù)結(jié)構(gòu)標準確定了四種不同的激發(fā)病毒融合蛋白通過構(gòu)象變化的機制，但是各種病毒融合蛋白都經(jīng)歷“完全融合→嵌膜的同源三聚體發(fā)卡前體→三聚體發(fā)卡(也稱作六螺旋體)”等相同的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，最終促進病毒與細胞膜融合[29]。Shutoku也曾報道病毒融合多采用兩步法，受體在中性pH時被激活，隨后通過酸性環(huán)境完成膜融合。所有Ⅰ類融合蛋白在病毒表面就以一種亞穩(wěn)的三聚體形式存在，這種結(jié)構(gòu)通過跨膜區(qū)固定在病毒的囊膜上，經(jīng)過酸性環(huán)境誘變亞穩(wěn)三聚體即轉(zhuǎn)換成發(fā)夾前結(jié)構(gòu)中間體，暴露融合肽與細胞膜雙分子層結(jié)合[21]。然而冠狀病毒S蛋白轉(zhuǎn)化成六螺旋體結(jié)構(gòu)，是需要利用胰酶裂解完成的，因為有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PEDV胰酶分離株CV777相比細胞適應(yīng)株DR13(培養(yǎng)無需胰酶)在胰酶裂解后S蛋白的S2′位點保留一個精氨酸(R)殘基，而DR13該位點的R突變?yōu)楦拾彼?G)，但是大多數(shù)冠狀病毒的S2′位點是R，這樣就可以合理解釋為什么DR13可以不依賴胰酶培養(yǎng)[30]。結(jié)合以上研究發(fā)現(xiàn)，即使不同的病毒融合過程有略微的區(qū)別，但是通過胰酶或者酸堿度作用后都會形成穩(wěn)定的融合結(jié)構(gòu)。這就預(yù)示病毒具有相同的融合結(jié)構(gòu) ,而冠狀病毒作為最大的RNA病毒需要胰酶的刺激才可形成六螺旋體，是因為S蛋白S2′位點R的存在，而胰酶成為觸發(fā)這種結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因素，所以PEDV S蛋白通過胰酶裂解才可發(fā)生構(gòu)象改變。

3.3 胰酶促進PEDV感染細胞 大多數(shù)冠狀病毒都可以誘發(fā)體外感染的細胞發(fā)生細胞間的融合，Hingley報道冠狀病毒MHV-2在感染細胞時，經(jīng)胰酶處理可以觀察到合胞體的形成[31]。有研究證實PEDV和牛冠狀病毒接種細胞同樣在胰酶處理下，可觀察到多核體的形成。但是PEDV感染細胞形成合胞體，只有在胰酶處理后才可以觀察到明顯的細胞病變。而不經(jīng)胰酶處理PEDV是不能有效的在培養(yǎng)細胞中增殖，形成細胞病變[17,32-33]。這是因為PEDV進入細胞時，胰酶會使S蛋白形成易于融合的構(gòu)象，增強病毒對Vero細胞吸附，促進融合活動的發(fā)生。隨著病毒感染并增殖，臨近的細胞發(fā)生相互融合，形成細胞病變。Park報道利用10 μg/mL胰酶在接種前分別對PEDV、Vero細胞進行預(yù)處理10 min和在接種后立即加入胰酶，PEDV感染的效果不同。在對細胞和病毒分別預(yù)處理不會增加病毒的滴度，然而在接種時加入胰酶會明顯使病毒滲透到細胞內(nèi)。胰酶只會在PEDV吸附細胞時，誘導(dǎo)膜融合的發(fā)生，增加病毒的感染[34]。因此在對PEDV分離過程中掌握合適胰酶處理的時間段會影響病毒的有效分離。

有研究表明分別利用胰酶和絲氨酸蛋白酶(TMPRSS2)處理接種PEDV后的Vero細胞病毒滴度明顯增高，而且能形成明顯的多細胞融合體，Shirato學(xué)者曾利用病毒已經(jīng)感染的Vero細胞在無胰酶的條件下，培養(yǎng)3 d后短暫的加入胰酶發(fā)現(xiàn)感染的病毒立即從細胞表面釋放到培養(yǎng)液，經(jīng)實驗證明是外源的胰酶提高細胞培養(yǎng)液中病毒的滴度，顯示胰酶才是使病毒從感染的細胞中釋放的關(guān)鍵因素[20,28]。因為PEDV感染的細胞上沒有蛋白酶的存在，病毒粒子在感染的細胞表面以簇或聚集體的形式存在，通過隨后的胰酶處理才使病毒粒子釋放到細胞培養(yǎng)液中[35]。這種現(xiàn)象表明是胰酶的作用，使病毒有效的從細胞中釋放。胰酶的這種作用與神經(jīng)氨酸酶(NA)促進禽流感病毒從感染的細胞表面上受體釋放的過程是相同的[36]。胰酶的這些作用非常有助于PEDV的分離和其致病機制的研究[20]。

在動物體內(nèi)內(nèi)源性蛋白酶如弗林蛋白酶、質(zhì)膜蛋白酶和內(nèi)溶酶體蛋白酶等，都能有利于PEDV的S蛋白裂解，促進其感染腸上皮細胞[28,37]。PEDV在體外分離需要借助胰酶的修飾，其實是模擬體內(nèi)感染過程中病毒粒子借助內(nèi)源性蛋白酶的作用感染靶細胞。在PEDV的繁殖過程中胰酶是病毒感染和釋放所必需的，日本學(xué)者通過長滿單層Vero細胞的24孔培養(yǎng)板中，使用MK毒株接種，并設(shè)置了存在胰酶和無胰酶的兩種條件，接種后用PBS代替培養(yǎng)液，檢測發(fā)現(xiàn)在胰酶存在條件下PEDV的滴度是無胰酶的1000倍左右。隨后又分別把已經(jīng)感染病毒的Vero細胞，用無胰酶的培養(yǎng)液在37 ℃溫箱中培養(yǎng)三天，棄掉培養(yǎng)液利用PBS沖洗2次，在室溫用胰酶處理5 min。通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)胰酶處理后的培養(yǎng)液病毒濃度明顯比不經(jīng)胰酶處理的高[20]。所以PEDV野毒株分離培養(yǎng)是嚴格需要體外的胰酶處理，病毒才會有效的感染細胞，促進病毒的增殖和加快細胞病變的形成，最終胰酶使病毒粒子從細胞表面釋放。總之,胰酶在病毒感染和釋放中的一系列作用，暗示其在PEDV野毒株分離過程中扮演至關(guān)重要的角色。同時這可能預(yù)示著體內(nèi)蛋白酶會使PEDV介導(dǎo)的腹瀉感染加重。如果是這樣，對于PEDV的防控，蛋白酶抑制劑會是一種理想的治療藥物。

4 胰酶在PEDV分離中的應(yīng)用

PEDV從開始流行經(jīng)歷了十多年的時間Hoffman等通過利用Vero細胞在胰酶存在的條件下培養(yǎng)出PEDV[38]。然而至今，仍然沒有穩(wěn)定分離培養(yǎng)的方法。多數(shù)學(xué)者都是嘗試利用在培養(yǎng)液中加入胰酶，通過上述胰酶可促進構(gòu)象變化的作用分離病毒。目前多采用Vero細胞作為病毒分離的宿主，因為它能抵抗高濃度胰酶的作用，同時滿足PEDV感染對胰酶的需求。Kadoi 等學(xué)者在PK、ST、CPK和ESK等細胞在培養(yǎng)液中添加胰酶成功培養(yǎng)了PEDV，并可以產(chǎn)生明顯的細胞病變[39]。Liu 等報道PEDV 通過在細胞培養(yǎng)液中加入5 μg/mL胰酶，成功的在人源細胞系Huh-7，MRC-5生長并能產(chǎn)生明顯的CPE[40]。2013年美國學(xué)者通過在培養(yǎng)液加入5 μg/mL胰酶利用Vero細胞也成功的分離出兩株新型PEDV ISU13-19338E和ISU13-22038[41]。因此，可以通過試驗的目的和闡明的問題，選擇PEDV適應(yīng)的細胞系且結(jié)合胰酶的作用，找到PEDV野毒株穩(wěn)定分離培養(yǎng)的方法。

5 結(jié)語

上述資料表明，目前研究已經(jīng)證實胰酶通過裂解PEDV S 蛋白使其形成易于融合六螺旋體構(gòu)象，這個胰酶結(jié)合位點是在S2′的精氨酸殘基。隨著病毒的增殖，胰酶又可促進病毒從感染細胞中釋放，結(jié)合胰酶一系列作用可表明胰酶是PEDV 體外融合、感染和釋放的關(guān)鍵因素，且結(jié)合其體內(nèi)和體外相同的感染機制，也為PEDV積極防治提供了新思路。通過對胰酶在病毒分離培養(yǎng)中作用的研究進展，胰酶很可能是通過如下機制發(fā)揮作用：①胰酶裂解PEDV S蛋白激活信號肽通路，促使S1和S2與細胞膜受體結(jié)合發(fā)生細胞膜重排，產(chǎn)生易于感染細胞的六螺旋體結(jié)構(gòu)；②胰酶作為一種標準的絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶能與被裂解的冠狀病毒S蛋白上具有S2′精氨酸殘基的功能性受體結(jié)合，從而促進融合反應(yīng)的發(fā)生。希望在以后的研究中能最終揭示這一反應(yīng)機制。

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(編輯：侯向輝)

Progress on S Gene of the Porcine Epidemic Diarrhea Virus by Trypsin Effection

ZHU Jun-hui,WANG Jun-zheng,WANG Yi-ming,ZHAO Yan-li,WANG Kai,CHEN Xiao-qing,HU Gui-xue*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118,China)

Isolation and spike (S) protein of the Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) has been a research hotspot in recent years.This paper reviewed the international latest research progress of S protein of PEDV cleavaged by trypsin,S protein and its function,conformational change and fusion mechanism of S protein triggered by trypsin,aiming to provide certain reference for PEDV prevention.

porcine epidemic diarrhea virus;isolation;trypsin;S protein

吉林省重點科技攻關(guān)項目(20150204026NY)

朱俊輝，碩士研究生，從事動物分子病毒學(xué)研究。

胡桂學(xué)。E-mail: Huguixue901103@163.com

2015-10-21

A

1002-1280 (2015) 11-0051-06

S852.65