尹暉，孫雷，葉妮，王亦琳，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法研究

尹暉，孫雷，葉妮，王亦琳，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為建立雞蛋中硝基呋喃類代謝物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，采用內(nèi)標法定量，樣品在酸性條件下衍生化后，弱堿性條件下用乙酸乙酯提取后，用正己烷去除脂肪，高速離心去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，上機測試。液相色譜條件：色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為甲醇+10 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)，多反應監(jiān)測(MRM)方式進行采集。結(jié)果表明：硝基呋喃類代謝物在0.5～20 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.990。雞蛋中四種代謝物的檢測限均為0.25 ng/g，定量限均為0.5 ng/g。在0.5、1和5 ng/g三個添加濃度平均回收率為79.1%～109.4%，批內(nèi)和批間RSD均小于20%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、定性準確等特點。

雞蛋；硝基呋喃類代謝物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

硝基呋喃類藥物(Nitrofurans)是呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基團的一類人工合成抗菌藥，臨床常用的有呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮等，此類藥物具有廣譜抗菌作用，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲有殺滅作用。因此，常把該類藥物添加到動物飼料中，防止細菌性傳染病和作為促生長劑使用。Yndestad[1]研究發(fā)現(xiàn)呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物具有致突變和致癌作用。Kelly等[2]研究證明了硝基呋喃類藥物是一種誘導有機體基因突變的有害物質(zhì)。為此，歐盟早在1995年就禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗菌藥物，我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗菌藥物的禁令，但硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留仍不斷被檢出[3-4]。

由于硝基呋喃類藥物原型在飼喂動物體內(nèi)代謝迅速，數(shù)小時即可降解，而硝基呋喃類代謝物能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時間達數(shù)周之久，因此常通過檢測硝基呋喃類代謝物來監(jiān)測硝基呋喃類藥物的使用情況。由于該類物質(zhì)所要求的最低要求執(zhí)行限(MRPL)為1 ng/g[5]，液相色譜等常規(guī)儀器達不到該類物質(zhì)靈敏度的要求，因此歐盟、美國等國家都采用高靈敏、高選擇性的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對硝基呋喃類藥物的代謝物進行確證檢測。目前，在動物性食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測中，常用的方法主要是針對雞肉等動物組織中的硝基呋喃類代謝物殘留，而雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留檢測方法[6]較少報道。且標準方法中樣品前處理步驟繁瑣，有必要進行改進。本文在現(xiàn)有標準方法的基礎上，針對雞蛋的組織特點，對前處理過程進行了簡化，對樣品凈化進行了優(yōu)化，建立了定性定量準確、抗干擾能力強、檢測限低、測定快速的雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-Quattro Premier液質(zhì)聯(lián)用儀，Waters公司； AE260電子天平，Mettler Toledo公司；BiofugeStrators高速冷凍離心機，賀利氏公司；Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司；SIR4渦旋混合器，IKA公司。

1.2 藥品和試劑 AOZ、AMOZ、AHD、SEM·HCl和內(nèi)標AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-[1,2-15N2;13C，純度均大于99.0%，北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純，MERCK公司；正己烷為分析純；所用水為超純水。

1.3 對照溶液配制 精密稱定AOZ、AMOZ、AHD和SEM對照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準儲備液；量取標準儲備液適量，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標準工作液，再用20%甲醇水溶液稀釋成100 ng/mL的標準工作液。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相A相為甲醇，B相為10 mmol/L乙酸銨水溶液(梯度洗脫條件見表1)，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

注：1為即時變化，6為線性變化。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，毛細管電壓為3.8 kV，萃取電壓為2.0 V，RF透鏡電壓為0.5 V，源溫為110 ℃，霧化溫度為350 ℃，霧化氣速為650 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。多反應監(jiān)測離子情況見表2。

表2 硝基呋喃類代謝物和內(nèi)標的特征離子、錐孔電壓和碰撞能量

1.4.3 定性與定量 定性時試樣溶液中色譜峰的保留時間，應與校正溶液的保留時間一致，容許偏差為±5%，試樣溶液中的離子豐度比應與校正溶液的一致，容許偏差符合歐盟2002/657/EC決議[7]要求。定量方法采用同位素內(nèi)標法定量。

1.4.4 標準曲線繪制 準確配制0.5、1、2、4、10和20 ng/mL的系列混合對照溶液(含內(nèi)標4 ng/mL)，經(jīng)衍生化、提取、凈化和濃縮后，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進樣3針，按所得峰面積與相應內(nèi)標峰面積的比值與相應的對照溶液濃度作標準曲線，并依次計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 樣品前處理過程 稱取2(±0.02)g勻質(zhì)的雞蛋樣品于50 mL離心管內(nèi)，加適量的AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-[1,2-15N2;13C]混合內(nèi)標工作液、水4 mL、1 mol/L鹽酸0.5 mL和50 mmol/L2-硝基苯甲醛的二甲亞砜溶液150 uL，渦旋混勻，(37±1)℃避光振蕩水浴放置約16 h，衍生物中加入0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至7.2～7.4，加乙酸乙酯5 mL，渦旋，中速振蕩5 min，3000 r/min離心10 min，吸取上清液，再用乙酸乙酯5 mL重復提取一次，合并上清液，于50 ℃水浴下氮氣吹干濃縮至干，用20%甲醇水溶液0.5 mL溶解殘余物，并加入20%甲醇水溶液飽和的正己烷2 mL，渦旋混勻，4 ℃下5000 r/min離心5 min，去下清溶液過0.2 um濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4.6 方法靈敏度確定 將適量AOZ、AMOZ、AHD和SEM對照溶液加入到空白雞蛋中，經(jīng)上述方法進行前處理后，用UPLC-MS/MS檢測，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對應藥物濃度，S/N>3者定其為方法的檢測限；S/N>10者定其為方法的定量限。

1.4.7 準確度和精密度的測定 采用標準添加法，在空白雞蛋中各添加0.5、1、5 ng/g三個不同濃度藥物進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 按照上述系列標準溶液濃度進行線性回歸，得到的回歸方程及變異系數(shù)見表3。從表中可以看出AOZ、AMOZ、AHD和SEM在0.5～20 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均>0.990。

表3 硝基呋喃類代謝物線性回歸情況

2.2 方法靈敏度 按上述方法進行處理，當添加濃度為0.5 ng/g時，測得AOZ、AMOZ、AHD和SEM的S/N>10，說明方法定量限為0.5 ng/g。當添加濃度為0.25 ng/g時，測得四種藥物S/N>3，表明方法檢測限為0.25 ng/g。1 ng/g添加樣品中AOZ、AMOZ、AHD和SEM及其內(nèi)標特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

1:AHD(249.1>133.8)；2:AHD(252.1>133.8)；3:AOZ(236.2>133.8)；4:AOZ(240.2>133.8)；5:SEM(209.1>166)；6:SEM(212.1>168)；7:AMOZ(335.3>291.3)；8:AMOZ(340.3>296.3)。圖1 1 ng/g空白雞蛋添加樣品中藥物及內(nèi)標特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 方法精確度 在空白雞蛋中各添加三個不同濃度硝基呋喃類代謝物進行回收率試驗，結(jié)果匯總見表4?？梢钥闯鲭u蛋中硝基呋喃類代謝物平均回收率為79.1%～109.4%，批內(nèi)RSD為4.5%～9.1%，批間RSD為6.6%～10.2%。

表4 雞蛋中硝基呋喃類代謝物添加回收率試驗結(jié)果

3 討論與小結(jié)

方法簡化了雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留檢測方法的前處理步驟，提高了操作簡便性。在現(xiàn)有的標準方法中，前處理時通常要采取不同的洗滌方法對試料進行洗滌[8-9]，步驟繁瑣，容易造成回收率降低。洗滌的目的在于去除影響質(zhì)譜信號的干擾性雜質(zhì)、游離態(tài)的硝基呋喃類代謝物以及外源性的SEM(氨基脲)等，而在雞蛋中沒有游離態(tài)的硝基呋喃類代謝物，因此本方法省去了洗滌步驟，這不僅簡化了前處理過程，且有助于提高回收率。

另外，研究提高了凈化效果，優(yōu)化了凈化過程。在硝基呋喃類代謝物殘留檢測過程中，發(fā)現(xiàn)樣品的凈化效果一直不夠理想，常常導致液質(zhì)聯(lián)用儀的錐孔堵塞，影響上機效率，易損傷儀器，因此凈化步驟亟需進一步優(yōu)化。在目前常用的方法中，樣品經(jīng)過前處理仍殘留有很多脂肪，本方法使用正己烷去除脂肪，采用高速離心的方式進一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，大大提高了凈化效果，優(yōu)化了凈化過程。通過方法線性、靈敏度、回收率和精密度等技術(shù)參數(shù)的考察，發(fā)現(xiàn)本方法均能滿足殘留檢測方法的要求，定性定量準確，靈敏度高，為雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留檢測提供了一個針對性強和更加簡便快捷的選擇。

[1] Steffenak I,Hormazabal V,Yndestad M.Reservoir of quinolone residues in fish[J].Food AdditContam,1991,Nov-Dec;8(6):777-780.

[2] Kelly B D,Heneghan M A,Bennani F,etal.Nitrofurantoin-induced hepatotoxicity mediated by CD8+ T cells[J].Am J Gastroenterol.1998 May;93(5):819-21.

[3] 陳威風，陳敬鑫．肉制品中硝基呋喃類藥物殘留的研究進展[J]．肉類研究，2011，25(12)：53—57．

[4] 禁用藥物中孔雀石綠、氯霉素和硝基呋喃類使用頻率高[J]．海洋與漁業(yè)，2011(11)：2．

[5] 歐盟.歐盟2003/181決議[S].

[6] 耿士偉，朱永林，邵德佳.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞蛋中呋喃唑酮代謝物的殘留[J].獸藥與飼料添加劑，2005,10(5)：30-31.

[7] 歐盟.歐盟2002/657/EC決議[S].

[8] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 21311-2007，動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[9] 農(nóng)業(yè)部.781號公告-4-2006，動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

(編輯：陳希)

Determination of Nitrofurans Metabolites Residues in Egg by UPLC-MS/MS

YIN Hui,SUN Lei,YE Ni,WANG Yi-lin,WANG He-jia,XU Shi-xin

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

An UPLC-MS/MS method was established for the determination of Nitrofurans metabolites residues in chicken egg.The samples were extracted by ethyl acetate in alkaline condition,then the fat was removed by n-hexane,and the protein was deposited by high speed centrifugation.LC conditions were as follows: the chromatography column is BEH C18 column of 50 mm×2.1 mm,1.7 μm,mobile phase is methanol and water(10mmol/L ammonium acetate),column temperature is 30 ℃,flow rate is 0.3 mL/min,injection volume is 10 μL.Mass spectrometry conditions were ESI+and MRM mode.And internal standard method was employed for quantification.The calibration curve of Nitrofurans metabolites were good linear from 0.5 to 20 ng/mL with the correlation coefficientR2over 0.990,respectively.The limit of detection of the method was 0.25 ng/g,and the limit of quantification was 0.5 ng/g.The average recoveries of Nitrofurans metabolites from spiked egg at three concentrations of 0.5,1 and 1.5 ng/g were 79.1%～109.4%,and intra- and inter-batchRSDwere <20%.

egg; nitrofurans metabolites; UPLC-MS/MS

2015年國家畜產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估項目(GJFP2015008)

尹暉，碩士，從事獸藥殘留方面的研究工作。E-mail: yinhui@ivdc.gov.cn

2015-10-10

A

1002-1280 (2015) 12-0042-05

S859.84