張?chǎng)危瑓莿ζ?，李丹妮，?yán)鳳，曹瑩，顧欣

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

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UPLC-MS/MS檢測(cè)七種動(dòng)物源食品中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留量的研究

張?chǎng)危瑓莿ζ?，李丹妮，?yán)鳳，曹瑩，顧欣*

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

研究并優(yōu)化了七種不同動(dòng)物源食品中四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。選用Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液作為提取液，超聲提取七種動(dòng)物源食品中四環(huán)素類(lèi)殘留，C18固相萃取小柱凈化，脫溶劑后用甲醇水溶解，在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，豬肉、雞肉、雞蛋、魚(yú)肉、牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，在定量限到2倍最大殘留限量(MRL)的添加范圍內(nèi)，回收率為75%±25%,RSD<10%，可以滿足農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告的要求。

獸藥殘留；四環(huán)素類(lèi)；優(yōu)化；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

隨著人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)畜產(chǎn)品的需求更加多樣化，對(duì)食品質(zhì)量安全的要求也更高，四環(huán)素類(lèi)等抗生素在動(dòng)物性食品中的殘留問(wèn)題受到關(guān)注。四環(huán)素類(lèi)藥物是一類(lèi)廣譜抗生素，在畜禽、水生生物等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用此類(lèi)藥物可對(duì)動(dòng)物進(jìn)行診斷、預(yù)防和治療疾病，同時(shí)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率，帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。養(yǎng)殖中濫用四環(huán)素類(lèi)藥物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)該類(lèi)藥物的殘留，人們長(zhǎng)期食用這種動(dòng)物食品及其制品，會(huì)危及身體健康。農(nóng)業(yè)部在235號(hào)公告中規(guī)定了四環(huán)素類(lèi)藥物在動(dòng)物性食品中最高殘留限量(MRL)，以監(jiān)管養(yǎng)殖業(yè)規(guī)范用藥。目前已發(fā)布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-2-2007及GB/T 5009.116-2003)及文獻(xiàn)方法多為液相色譜法[1-2]，檢測(cè)限及靈敏度受到檢測(cè)器的局限。已發(fā)布的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有兩個(gè)，GB/T 21317-2007中方法檢測(cè)限定為50 μg/kg，且未涉及雞蛋中四環(huán)素類(lèi)殘留量的檢測(cè)方法，農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-12-2008僅適用于豬肉、雞肉組織中四環(huán)素、土霉素及金霉素殘留量的檢測(cè)。已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]針對(duì)不同基質(zhì)給出的檢測(cè)方法各異，給實(shí)際監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)了不便。本文在已有工作的基礎(chǔ)上，針對(duì)我國(guó)消費(fèi)量較大的豬肉、雞肉、雞蛋、魚(yú)肉、牛奶、豬肝、豬腎等7種組織，制定出相對(duì)統(tǒng)一的檢測(cè)方法，通過(guò)考察前處理操作和儀器條件對(duì)結(jié)果的影響，優(yōu)化檢測(cè)方法，為實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性食品中四環(huán)素藥物殘留的確證檢測(cè)、有效監(jiān)控四環(huán)素類(lèi)藥物的使用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters TQ Xevo串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(ESI+)、固相萃取小柱(Waters HLB 3mL/60mg)、C18色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，美國(guó)Beckman Coulter)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。標(biāo)準(zhǔn)品：土霉素(純度98.5%)、四環(huán)素(純度96.5%)、金霉素(純度92%)、多西環(huán)素(純度98.7%)，均為SIGMA公司生產(chǎn)。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國(guó)Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；草酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸，為化學(xué)純；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：精密稱(chēng)取土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。取土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素貯備液適量，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并用甲醇/水溶液(50:50，V/V)稀釋成濃度為1、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜方法 色譜柱：C18柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸，采用梯度洗脫：20%A起始，4 min時(shí)變化至50%A，保持0.5 min，5 min時(shí)變化至20%A。

1.2.2 質(zhì)譜方法 離子源：ESI+；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；電離電壓3.2 kV；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；霧化氣流速800 L/h。定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞電壓見(jiàn)表1。

表1 四環(huán)素類(lèi)藥物的定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

1.2.3 前處理方法 提取方法：①豬肉、雞肉、雞蛋、魚(yú)肉：稱(chēng)取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入15 mL提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液[2])，充分振蕩5 min，然后于0 ℃離心5 min(離心力8000 g)，轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管中，準(zhǔn)確加入15 mL提取液重復(fù)提取一次，合并上清液備用。②豬肝、豬腎：稱(chēng)取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入25 mL提取液，5%三氯乙酸5 mL，充分振蕩10 min，于0 ℃離心5 min，上清液備用。③牛奶：稱(chēng)取5.00 g牛奶于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入提取液定容至30 mL，充分振蕩5 min，0 ℃離心5 min，上清液備用。

凈化方法：HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水、提取液各3 mL活化。取備用液6 mL過(guò)柱，用3 mL 5%甲醇水淋洗，抽干，用0.01 mol/L草酸甲醇溶液4 mL洗脫，收集洗脫液，60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL甲醇/水溶液(50:50,V/V)溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。若待測(cè)樣品濃度超出線性范圍，用甲醇/水溶液(50:50,V/V)稀釋至線性范圍后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，數(shù)據(jù)表明在1～100 ng/mL范圍內(nèi)，四種藥物的線性相關(guān)系數(shù)R>0.999，線性良好。

圖1 四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線濃度范圍為1～100 ng/mL)(A：土霉素；B：四環(huán)素；C：金霉素；D：多西環(huán)素)

2.2 方法回收率 在確定樣品預(yù)處理方法后，選擇豬的肌肉、肝臟、腎臟，雞肉、雞蛋，牛奶，魚(yú)肉作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，添加四環(huán)素類(lèi)濃度為方法定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個(gè)濃度的試樣的樣品，考察方法的準(zhǔn)確性和精密度。同一濃度做6次平行實(shí)驗(yàn)，平均回收率R及標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD見(jiàn)表2，結(jié)果表明，土霉素、金霉素、多西環(huán)素回收率達(dá)到70%～100%，四環(huán)素回收率達(dá)到50%～80%，RSD<10%，表明該方法對(duì)不同基質(zhì)樣品中不同含量的四環(huán)素類(lèi)藥物的測(cè)定均有較好的準(zhǔn)確度(圖2)。

表2 四環(huán)素類(lèi)檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度數(shù)據(jù)結(jié)果表

圖2 基質(zhì)添加回收MRM譜圖(A四環(huán)素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品20 ng/mL；B空白豬肉中添加20 ng/g； C空白牛奶中添加20 ng/g； D空白豬腎中添加20 ng/g)

2.3 靈敏度、檢測(cè)限和定量限 UPLC-MS/MS對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的檢測(cè)靈敏度低至1 ng/mL(圖3)，信噪比S/N(Peak to Peak)均遠(yuǎn)大于10，根據(jù)前處理方法的稀釋倍數(shù)為1，推測(cè)方法定量限可定為1 μg/kg，檢出限可以更低，但由于存在基質(zhì)干擾，1 μg/kg添加回收率超出100%，定量不準(zhǔn)，因此本方法不能簡(jiǎn)單用S/N>3來(lái)確定檢測(cè)限，S/N>10來(lái)確定定量限，考慮到添加回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，豬肉、雞肉、雞蛋、魚(yú)肉、牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，信噪比見(jiàn)圖4所示。

3 討論與小結(jié)

3.1 流動(dòng)相的選擇 通過(guò)比較四種流動(dòng)相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01 mol/L三氟乙酸梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中未加入0.1%甲酸的情況下，四環(huán)素類(lèi)藥物的電離效果較差，峰型對(duì)稱(chēng)性差，在加入一定比例的0.1%甲酸后，得到了改善，0.01 mol/L三氟乙酸也有類(lèi)似的效果，考慮到0.1%甲酸更適合質(zhì)譜，最終選擇乙腈∶0.1%甲酸作為流動(dòng)相。

圖3 四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品MRM圖(濃度為1 ng/mL)

圖4 添加回收樣品MRM圖信噪比(A豬肉中四環(huán)素類(lèi)藥物添加濃度10 μg/kg；B豬肝中四環(huán)素類(lèi)藥物添加濃度20 μg/kg)

3.2 工作液稀釋溶劑的選擇 嘗試選擇溶劑分別為0.2%甲酸、0.2%甲酸/甲醇(80/20,V/V)、0.01 mol/L三氟乙酸/乙腈(50/50,V/V)、甲醇/水(20/80,V/V)、甲醇/水(50/50,V/V)等作為最終進(jìn)樣前的樣品溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溶劑pH值對(duì)樣品的影響較大，而甲醇與水的比例對(duì)樣品的影響較小，但高有機(jī)相比例的溶劑對(duì)樣品殘?jiān)娜芙庑暂^好，為保持一致，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶劑選擇甲醇/水(50/50,V/V)。

3.3 提取溶劑的選擇 使用McIlvaine-Na2EDTA緩沖液、5%高氯酸溶液、乙腈三種提取溶劑，對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物添加量為20 μg/kg的豬肉樣品進(jìn)行提取，比較回收率發(fā)現(xiàn)，5%高氯酸溶液、乙腈對(duì)四種藥物的提取效率均在53%～70%之間，當(dāng)提取溶劑為McIlvaine-Na2EDTA緩沖液時(shí)多西環(huán)素和金霉素的提取效率有明顯提高，分別達(dá)到74.8%和100.2%，而土霉素和四環(huán)素變化較小，分別為69.0%和65.3%，這主要是McIlvaine-Na2EDTA緩沖液競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金屬離子，一定程度上減少了四環(huán)素類(lèi)藥物與金屬離子的螯合反應(yīng)，保證藥物的游離性，有利于藥物在SPE柱上保留。

3.4 定量方法的選擇 根據(jù)前處理實(shí)驗(yàn)情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)凈化后，絕對(duì)回收在50%～60%，嘗試選擇去甲基金霉素作為內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)與四環(huán)素類(lèi)藥物的回收率不一致，因此仍選擇外標(biāo)法定量，通過(guò)改進(jìn)前處理方法以提高回收率。

3.5 去除蛋白方法的選擇 使用三氯乙酸(5%)、硅鎢酸(5%)、高氯酸(1%，2%，5%，10%)、正己烷去脂、濾紙過(guò)濾等凈化方法對(duì)豬肝樣品(添加量為20 μg/kg)的提取液進(jìn)行凈化，比較回收率發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同基質(zhì)，結(jié)果有所不同。對(duì)于豬肉、雞肉、魚(yú)肉、牛奶、雞蛋等，加去蛋白或去脂的試劑意義不大，但對(duì)于豬肝、豬腎等，此步驟可以提高回收。使用三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)可得到相對(duì)較高的回收率，其中土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和金霉素的回收率最高可達(dá)79.0%、68.2%、79.0%和98.5%。對(duì)于豬肝、豬腎樣品，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)作為凈化試劑。

3.6 固相萃取柱的選擇 比較了Waters HLB、BondElut C18、Agilent OPT固相萃取小柱的凈化效率，后兩者比HLB小柱略低，三種型號(hào)沒(méi)有明顯差異，C18填料的固相萃取小柱均可以滿足要求。同時(shí)，比較規(guī)格為3mL/60mg和6mL/150mg的HLB固相萃取小柱，發(fā)現(xiàn)相同的上樣量，6 mL小柱需要兩倍體積以上的溶劑洗脫才能與3 mL的小柱回收率相當(dāng)，增加工作量及成本，而回收率沒(méi)有顯著差別，因此選擇規(guī)格為3mL/60mg的小柱。

3.7 固相萃取方法的選擇 C18填料的固相萃取小柱，通常使用甲醇、水活化，但是，四環(huán)素類(lèi)藥物在弱酸性環(huán)境中更穩(wěn)定，因此使用提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液)提供弱酸性柱上環(huán)境，發(fā)現(xiàn)回收率提高10%。同時(shí)，提取液上樣量應(yīng)與SPE填料量相匹配，考察了對(duì)3mL/60mgWaters HLB固相萃取小柱上樣量分別為3、6、10 mL對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)3 mL和10 mL均低于上樣量為6 mL時(shí)的回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化前處理和儀器條件，提高了回收率。本文考察了該方法對(duì)多種基質(zhì)的適用性，并提出改進(jìn)方案，給出不同基質(zhì)的定量限，是對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)和補(bǔ)充，可為動(dòng)物源食品中的四環(huán)素類(lèi)殘留的檢測(cè)提供可靠的確證方法。

[1] 龐國(guó)芳,曹彥忠,張進(jìn)杰,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2005,4:61-63.[2] 張?chǎng)?顧欣,嚴(yán)鳳,等.高效液相色譜法檢測(cè)畜禽肉中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留的條件優(yōu)化[J].化學(xué)分析計(jì)量,2010,5:55-58.

[3] 孫雷,張?bào)P,劉琪,等.豬肉組織中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留檢測(cè)——高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2008,2:27-29.

[4] 劉艷華,張純萍,門(mén)立強(qiáng),等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肌肉組織中的四環(huán)素類(lèi)藥物殘留[J].色譜,2006,2:171-173.

[5] 李月歡,劉志權(quán),陳硯朦,等．UPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)畜、禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,1:96-98.

[6] 洪武興,孫良娟,劉益鋒,等.液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)水產(chǎn)品中四環(huán)素類(lèi)殘留[J].現(xiàn)代食品科技,2010,7:756-758.

[7] 賈薇,孫璐,史向國(guó),等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定牛奶中4種四環(huán)素類(lèi)藥物殘留量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,2:96-100.

[8] 岳振峰,邱月明,林秀云,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中四環(huán)素類(lèi)抗生素及其代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué),2006,9:1255-1259.

(編輯：侯向輝)

Optimized Determination of Tetracyclines in Seven Kinds of Animal Derived Food by UPLC/MS/MS

ZHANG Xin,WU Jian-ping,LI Dan-ni,YAN Feng,CAO Ying,GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A UPLC/MS/MS method for determination of the residues of tetracyclines(tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline)in seven different kinds of animal derived food was studied and optimized.The tetracyclines in seven kinds of animal derived food were pretreated with extraction by Na2EDTA-McIlvaine buffer solution，purification by C18 SPE column,dissolution by CH3OH/H2O(50/50,V/V) after desolvation，and then determined by UPLC/MS/MS.The results showed that the recoveries were in the range of 50%～100% when blank samples spiked with tetracyclines in 10 μg/kg or 20 μg/kg～2MRL,and the relative standard deviation was less than 10%.The method could satisfy the request of legislation on maximum residue limits in the ministry of agriculture 235 announcement.

veterinary residue；tetracyclines；optimize；UPLC/MS/MS

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃(滬農(nóng)青字(2014)第2-5號(hào))；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2013)第6-9號(hào))

張?chǎng)?，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析研究。

顧欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-10-27

A

1002-1280 (2015) 12-0036-07

S859.84