徐剛，吳學(xué)淵，房春林

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；2.成都乾坤動物藥業(yè)有限公司，成都 611130)

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HPLC法同時測定復(fù)方蒲公英顆粒中秦皮乙素和咖啡酸的含量

徐剛1，吳學(xué)淵2，房春林1

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；2.成都乾坤動物藥業(yè)有限公司，成都 611130)

為了建立復(fù)方蒲公英顆粒的可控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立了同時測定復(fù)方蒲公英顆粒中秦皮乙素和咖啡酸含量的高效液相色譜法，并測定樣品中兩種成分的含量。采用WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)為流動相，體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為326 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果表明，秦皮乙素和咖啡酸分別在0.02～0.32 mg/mL和0.004～0.064 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加樣回收率分別為100.08%和99.69%，RSD分別為0.98%和0.84%。本方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，重現(xiàn)性好，可用于復(fù)方蒲公英顆粒產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；復(fù)方蒲公英顆粒；秦皮乙素；咖啡酸

復(fù)方蒲公英顆粒為本單位研發(fā)中的新獸藥產(chǎn)品，由蒲公英、紫花地丁、甘草等四味中藥組成，前期研究表明，本制劑具有清熱解毒，涼血消腫的功效，主要用于豬外感熱病的輔助治療，癥見體溫升高、口渴貪飲等?？Х人釣槠压⒌闹饕行С煞种?，具有顯著的抗菌，抗病毒，中樞興奮等作用[1-2]，秦皮乙素為紫花地丁主要有效成分之一，具有明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。中獸藥復(fù)方制劑的化學(xué)成分復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量的控制往往需要檢測多種有效成分，而每種成分的檢測方法和條件往往各有差異，程序繁瑣復(fù)雜，耗時較長，工作量大，因此，在進行中獸藥復(fù)方制劑特別是新獸藥復(fù)方制劑研發(fā)中，建立對產(chǎn)品中與療效相關(guān)的多種成分含量同時進行測定的HPLC方法，能夠大大加快分析檢測速度，具有重要的價值和實際意義。因此，為了建立復(fù)方蒲公英顆粒的可控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，試驗選擇秦皮乙素和咖啡酸作為指標(biāo)成分，對兩種成分的含量測定方法進行了研究，由于分別建立兩種成分的檢測方法費時費力，為提高產(chǎn)品質(zhì)量控制效率，研究旨在建立同時測定復(fù)方蒲公英顆粒中秦皮乙素和咖啡酸含量的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 1260 infinity高效液相色譜儀,Agilent公司，OpenLAB CDS色譜數(shù)據(jù)工作站，四元泵、自動進樣器、紫外檢測器；KQ5200DE超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；CPA225D型電子分析天平,德國Sartorius公司，十萬分之一；甲醇為色譜純,Fisher公司，水為注射用水，其它試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品 秦皮乙素對照品,批號：110741-200506，由中國食品藥品檢定研究院提供；咖啡酸對照品,批號：110885-200102，由中國食品藥品檢定研究院提供；復(fù)方蒲公英顆粒,批號：130501，130502，130503，由成都乾坤動物藥業(yè)有限公司研制。

1.3 溶液配制

1.3.1 混合對照品溶液 精密稱取咖啡酸對照品20 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；另取秦皮乙素對照品20 mg，置50 mL容量瓶中，用配制好的咖啡酸對照品溶液溶解并定容至刻度；取該混合對照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含咖啡酸和秦皮乙素濃度分別為0.016 mg/mL、0.08 mg/mL的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液 取復(fù)方蒲公英顆粒粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率32 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 陰性樣品溶液 取缺蒲公英和紫花地丁的雙陰性樣品顆粒，按供試品溶液的制備方法制備。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為島津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)，體積流量1.0 mL/min，檢測波長326 nm，柱溫25 ℃。

1.4.2 測定方法 取3批復(fù)方蒲公英顆粒(批號130501、130502、130503)，按1.3項方法制備混合對照品溶液和供試品溶液，分別取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖和峰面積，以外標(biāo)法計算各成分含量。

1.5 方法學(xué)驗證

1.5.1 專屬性 分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按1.4.1項色譜條件進樣，記錄色譜圖和峰面積。

1.5.2 線性范圍 精密稱取咖啡酸對照品、秦皮乙素對照品，用甲醇稀釋至含秦皮乙素濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mg/mL，含咖啡酸濃度分別為0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/mL的混合對照品溶液，分別吸取各混合對照品溶液10 μL，進樣，記錄峰面積值；以峰面積(y)對對照品濃度(x)進行線性回歸。

1.5.3 精密度試驗 分別取混合對照品溶液，按1.4.1項色譜條件，重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖和峰面積，并計算RSD值。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗 取混合對照品溶液與供試品溶液，按1.4.1項色譜條件分別于0、2、4、6、8、10h進樣測定，記錄色譜圖和峰面積，并計算RSD值。

1.5.5 重復(fù)性試驗 取復(fù)方蒲公英顆粒約3g，分別按1.3.2項方法制備供試品溶液，平行制備6份，進樣測定，記錄色譜圖和峰面積，以外標(biāo)法計算各成分含量。

1.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的復(fù)方蒲公英顆粒約1.5g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入秦皮乙素對照品儲備液(0.178mg/mL)和咖啡酸對照品儲備液(0.0344mg/mL)各5mL，精密加甲醇15mL，平行操作6份，按1.3.2項方法制備加樣回收供試品溶液，分別進樣測定，記錄峰面積和色譜圖，并計算加樣回收率。

2 結(jié)果

2.1 含量測定 結(jié)果表明,不同批次復(fù)方蒲公英顆粒中秦皮乙素和咖啡酸的含量穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、可控。本方法可用于同時測定復(fù)方蒲公英顆粒中秦皮乙素和咖啡酸含量。試驗結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方蒲公英顆粒樣品含量測定結(jié)果(n=3)

2.2 專屬性

結(jié)果表明，在秦皮乙素和咖啡酸色譜圖相應(yīng)位置無干擾峰出現(xiàn)，證明本樣品含量測定方法專屬性強。結(jié)果見圖1。

A.混合對照品溶液HPLC色譜圖 B.供試品溶液HPLC色譜圖 C.陰性樣品溶液HPLC色譜圖 1.秦皮乙素 2.咖啡酸圖1 復(fù)方蒲公英顆粒液相色譜圖

2.3 線性范圍、精密度和穩(wěn)定性試驗 秦皮乙素回歸方程為：y=29829.884x-10.140，R2=0.9999，咖啡酸回歸方程為：y=53817.627x-10.482，R2=0.9999，秦皮乙素和咖啡酸分別在0.02～0.32mg/mL和0.004～0.064mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗結(jié)果表明，兩種成分RSD均小于1.5%。對照品溶液及供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于1.5%。

2.4 重復(fù)性試驗 測得秦皮乙素的平均含量為0.615mg/g，RSD小于1.5%，咖啡酸的平均含量為0.134mg/g，RSD小于1.5%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗 結(jié)果表明，秦皮乙素回收率平均值為100.08%，RSD為0.98%，咖啡酸回收率平均值為99.69%，RSD為0.84%，表明本方法可靠，準(zhǔn)確度好。結(jié)果見表2、表3。

表2 秦皮乙素加樣回收率試驗結(jié)果

表3 咖啡酸加樣回收率試驗結(jié)果

3 討論與小結(jié)

紫花地丁和蒲公英均為復(fù)方蒲公英顆粒處方中的主要藥材，其中紫花地丁主要有效成分之一為秦皮乙素，《中國獸藥典》2010年版尚未收載其含量測定方法，蒲公英主要有效成分之一為咖啡酸，其含量較低，《中國獸藥典》2010年版中規(guī)定藥材含咖啡酸量不得少于0.02%，在進行本制劑質(zhì)量研究時，在參考文獻資料[6-7]和多次對比試驗的基礎(chǔ)上，兼顧兩種成分在藥材中的含量高低，通過綜合比較兩種成分的物理化學(xué)性質(zhì)以及流動相極性的特點，最終采用HPLC法對兩種藥材中的兩種成分同時進行含量測定研究，對樣品取樣量、吸收波長、色譜柱類型等條件進行了系統(tǒng)的考察。

對檢測波長的篩選研究表明，秦皮乙素在353 nm處有最大吸收，咖啡酸在326 nm處有最大吸收，試驗對樣品在秦皮乙素和咖啡酸各自最大吸收波長下的分離情況和峰面積進行了對比，結(jié)果表明，在353 nm波長條件下，咖啡酸峰面積極小，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，不能滿足含量測定要求，而在326 nm波長條件下，秦皮乙素和咖啡酸兩種成分均有良好的吸收峰，無明顯雜質(zhì)干擾，因此確定檢測波長為326 nm。

根據(jù)文獻報道的色譜條件[7-8]，對復(fù)方蒲公英顆粒劑中秦皮乙素和咖啡酸兩種成分進行同時測定含量研究時，兩種成分的色譜峰存在相互干擾，分離度差，雜質(zhì)成分干擾也很嚴(yán)重，峰面積差異大。為此，分別采用甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)和乙腈-0.6%冰醋酸水溶液(8∶92)作為流動相，對Agilent -ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)和島津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)兩種色譜柱的樣品成分分離情況進行了對比試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用島津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)作為流動相，所檢測的兩種成分分離效果較好。在對柱溫條件的優(yōu)化篩選試驗中，分別比較了柱溫在20℃、25℃、30℃、35℃等條件下兩種成分分離情況以及峰形情況，結(jié)果表明，在25℃和30℃時兩成分色譜峰可達(dá)到基線分離，且與其它雜質(zhì)成分分離較好。

本研究建立的同時測定復(fù)方蒲公英顆粒劑中秦皮乙素和咖啡酸含量的HPLC方法，具有簡便、準(zhǔn)確、快速的特點，極大地提高了工作效率，并節(jié)約了人力物力，可用于復(fù)方蒲公英顆粒產(chǎn)品的質(zhì)量控制。同時本方法也可為紫花地丁藥材含量測定方法的建立奠定基礎(chǔ)，也為其他同時含有該兩種成分的制劑進行質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

[1] 凌云,張雅林,蔡少青，等.蒲公英黃酮類和甾醇類成分的研究[J].中國藥物化學(xué)雜志，1998，8(1)：46-48.

[2] 屠國昌.蒲公英化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2012，24(5): 33-35.

[3] 蔣喜巧，苗明三.蒲公英現(xiàn)代研究特點及分析[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，(7): 1024-1026.

[4] 黃霽秋，楊敬芝，薛清春，等.紫花地丁化學(xué)成分研究[J].中國獸藥雜志.2009，34(9): 1114.

[5] 劉湘新，劉進輝，劉自逵，等.紫花地丁的有效成分分析及抗菌作用研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，23(3):16-18.

[6] 陳胡蘭，湯沛然，張梅.不同產(chǎn)地紫花地丁中秦皮乙素的含量比較[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，33(1)：72-74.

[7] 中國藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[S].

[8] 孟繁姝，趙春杰，李丹，等.HPLC法同時測定蒲丁合劑中秦皮乙素和咖啡酸的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2009，10(1)：38-40.

(編輯：陳希)

Simultaneously Determination of Aesculetin and Caffeic Acid in Compound Dandelion Granule by HPLC

XU Gang1,WU Xue-yuan2,FANG Chun-lin1

(1、ChengduVocationalCollegeofAgriculturalScienceandTechnology，Chengdu611130,China; 2、ChengduQiankunVeterinaryPharmaceuticalCo.,Ltd，Chengdu611130,China)

In order to improve the quality standard of compound dandelion granule,an HPLC method was established for simultaneously determination of aesculetin and caffeic acid in compound dandelion granule.The isolation was performed on a WondaCract ODS-2 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) with mobile phase consisting of methanol-0.6% glacial acetic acid(20∶80).The flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 326 nm and the column temperature was 25 ℃.The results showed that good linear relationship was obtained in the range of 0.02～0.32 mg/mL and 0.004～0.064 mg/mL respectively (R2=0.9999).Theaveragerecoveriesofaesculetinandcaffeicacidwere100.08%and99.69%withRSDof 0.98% and 0.84%.The method was accurate,sensitive and reliable with a good reproducibility and can be used as an quantitative analysis of aesculetin and caffeic acid in compound dandelion granule.

HPLC；compound dandelion granule；aesculetin；caffeic acid.

徐剛，碩士，副教授，從事動物疫病防治及新獸藥研發(fā)工作。E-mail：625406758@qq.com

2015-10-30

A

1002-1280 (2015) 12-0047-04

S853.73