馮洋洋,陳章寶

(1.西南大學藥學院,重慶 400715;2.西安思源學院護理學院,陜西 西安 710038)

胰酶是從哺乳動物的胰腺中提取并分離得到的一種混合酶,由多種酶組成,主要包括胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶等消化酶[1]。胰蛋白酶可促進人體蛋白質(zhì)分解,胰淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化成麥芽糖等二糖,胰脂肪酶具有幫助消化人體脂肪的能力[2]。因此,胰酶在臨床應用中占據(jù)一定地位。胰酶存在自身的缺點,酸性條件下,胰脂肪酶會很快失去活性,中性和堿性條件下,則保持較高活性[3]。為此,要求胰酶制劑應具備耐酸的能力,同時保證在腸道中必須有較高釋放度的特性,從而達到助消化作用。目前,關(guān)于胰酶制劑上市的產(chǎn)品有多酶片、胰酶腸溶片劑和膠囊劑[2]。多酶片硬度大,口服之后很難分解成小顆粒,不能與食糜同步進入十二指腸,導致胰酶中胰脂肪酶的穩(wěn)定性差,活性降低[4];胰酶腸溶片針對有吞服困難的患者不適合[2];胰酶腸溶膠囊里面的內(nèi)容物為胰酶腸溶微丸,在胃中釋放出分散體系的胰酶腸溶微丸,到達小腸后快速釋放胰酶發(fā)揮作用[5]。微丸粒徑小,屬于多元體系,有缺陷的個別微丸不會影響整體藥物釋放特性,藥物的穩(wěn)定性得到保證[6]。另外,它屬于分散體系,在胃腸道分布面積較大,刺激性小,提高了藥物的安全性[7]。關(guān)于胰酶制劑的活性和含量評價指標,胰脂肪酶起著決定性作用[8]。因此,在評價市售胰酶制劑時,通常選擇以胰脂肪酶的活性和含量作為關(guān)鍵指標[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JBZ-300離心式包衣制粒機(中國遼寧.醫(yī)藥新藥技術(shù)研究所);D-800LS藥物溶出儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司);TG16-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);UV-2700紫外分光光度計 (日本島津);sartoriUs普及型pH計(PB-10)(賽多利斯);680酶標儀(美國伯樂);DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1.2 試劑

胰酶(武漢三恒醫(yī)藥化工有限公司,胰蛋白酶活力≥1800U/g,胰淀粉酶活力≥21000U/g,胰脂肪酶活力≥12000U/g);胃蛋白酶(1:3000,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司);微晶纖維素(MCC)(上海風泓藥用輔料技術(shù)有限公司);交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCNa)(上海風泓藥用輔料技術(shù)有限公司);羥丙基甲基纖維素(HPMC)(安徽山河藥用輔料股份有限公司);滑石粉(成都市科龍化工試劑廠);檸檬酸三乙酯(東京化成工業(yè)株式會社);EUdragit L30D -55(德固賽);鹽酸、硫酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 人工胃液對胰酶活力的影響

依據(jù)《中國藥典》2015年版·二部中胰酶[6]項下關(guān)于活力的測定方法,稱取適量的胰酶粉3份,分別與人工胃液作用0.5 小時、1 小時、2 小時、3 小時、4 小時后,分別測定胰脂肪酶、胰蛋白酶和胰淀粉酶活力[10],觀察人工胃液對三種酶活力的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 人工胃液對胰酶活力的影響

從圖1可知,在4小時內(nèi),胰蛋白酶活力始終保持在0左右,說明活力很低;胰淀粉酶活力基本保持不變,約為20U/mg,人工胃液對胰淀粉酶活力無影響;胰脂肪酶在30分鐘時,活力由17U/mg變?yōu)?,完全失去活性,說明胰脂肪酶活力相對較高,但是不耐酸,需要抗酸保護,這一結(jié)果與相關(guān)文獻中采用胰脂肪酶活力表示胰酶腸溶制劑的溶出度結(jié)果相一致。因此,本實驗擬采用胰脂肪酶活力表示胰酶腸溶微丸中胰酶的溶出度。

2.2 載藥微丸處方

根據(jù)文獻和前期預實驗設(shè)計4個處方。以微丸是否成實心球型及微丸在18～24目(0.8～1.2mm)之間的收率為依據(jù),確定處方。

處方1:MCC∶CCNA∶HPMC:胰酶=8:2∶0.5∶4.5

處方2:甘露醇∶交聯(lián)聚維酮∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

處方3:甘露醇∶CCNA∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

處方4:MCC∶交聯(lián)聚維酮∶HPMC∶胰酶=8∶2∶0.5∶4.5

結(jié)果表明:處方1和處方4可以成丸,微丸硬度較好,收率分別為85%和69%;處方2和處方4都難以成丸,因此考慮選用處方1用 來制備微丸。

2.3 載藥微丸制備工藝

2.3.1 制備工藝流程

將處方中涉及到的胰酶粉、MCC、HPMC、CCNA等輔料分別過100目篩,隨后分別稱取處方比例用量,混合均勻,加適量水制成具有一定可塑性的軟材(手握成團、手松即散)[2],立即投入到擠壓機中,經(jīng)1.0毫米孔徑篩板擠成細條狀,迅速分批次加入到滾圓機內(nèi)進行制粒和滾圓工藝,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速、滾圓時間等因素,待顆粒完全滾圓時停止操作,取出制備的微丸放置于40℃烘箱中干燥20h,整粒后,即得胰酶微丸。

2.3.2 微丸評價指標

① 圓整度:將1.0 g胰酶微丸置一平板上,平板一側(cè)緩慢抬起,測量并記錄微丸滾動前傾斜平面與水平所夾的角(Φ),Φ值越小,說明胰酶微丸流動性越好,圓整度越好。

② 收率:通過18～24目(0.8～1.2mm)篩孔的胰酶微丸質(zhì)量記為m1,總投入量記為m,收率=m1/m*100%,收率越大越好[2]。

2.3.3 工藝條件優(yōu)化

3個制備工藝影響因素,即軟材擠出轉(zhuǎn)速(A)、微丸滾圓轉(zhuǎn)速(B)和時間(C),采用 L9(34) 正交設(shè)計實驗優(yōu)化工藝條件(見表1),用圓整度和收率兩個指標來評價工藝質(zhì)量,要求收率(y1)值越大越好,圓整度(y2)越小越好,綜合評分采用y=y1-y2表示,y值越大,代表相應的工藝條件越好,結(jié)果見表 2和表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

由表2和表3可知,影響胰酶微丸制備工藝因素大小的順序依次是B>C>A,B、C因素為顯著因素,擠出速度:924rpm>812rpm>700rpm,滾圓速度:504rpm>560rpm>616rpm;滾圓時間:8min>2min>5min,故最佳工藝為A3B1C3。

2.3.4 工藝驗證實驗

按照上述確定的胰酶微丸制備最佳工藝參數(shù),同步制備3批小試試驗進行驗證,結(jié)果表明制備工藝參數(shù)可靠,具體見表4。

表4 驗證實驗

2.4 載藥微丸的包衣

2.4.1 腸溶層包衣液的配置

取Eudragit L30D-55聚合物水分散體適量,用純化水稀釋至聚合物濃度為15%,攪拌均勻,備用。用純化水制備濃度12%的檸檬酸三乙酯混懸液,備用。將后者緩慢倒入前者溶液,加水稀釋至聚合物濃度為7.5 %,緩慢攪拌30min后,過80目篩網(wǎng),濾液即腸溶層包衣液。

2.4.2 包衣工藝流程

采用離心式包衣制粒機進行包腸衣。根據(jù)預實驗可知,向包衣鍋中加入適量整粒后的胰酶微丸,用濃度為1% HPMC混懸液包隔離層,包衣過程動態(tài)加入適量滑石粉。當隔離層厚度約為10%時,停止包衣,并取出包隔離層后的胰酶微丸于40℃烘箱中干燥約10min,隨后,將干燥過的包有隔離層的胰酶微丸再用腸溶層包衣液包衣,當腸衣層達到一定厚度,停止包衣,取出胰酶腸溶微丸,并于40℃烘箱干燥2h,即得。

2.4.3 腸溶層包衣液處方單因素考察

包衣增重對胰酶累計釋放度影響:分別稱取5份120g包有隔離層的胰酶微丸置于離心式包衣制粒機的包衣鍋內(nèi)進行包衣,包衣增重分別設(shè)置為25%、30%、35%、40%、45%,固其他條件不變,滑石粉適量,制備胰酶腸溶微丸,備用。選取《中國藥典》2015版·四部通則0931溶出度與釋放測定法的第二法,測定胰酶腸溶微丸的體外釋放度;采用《中國藥典》2015版·二部中胰酶項下的活力測定方法,測定不同包衣增重后胰酶腸溶微丸中胰脂肪酶活力,用活力來計算胰酶累計釋放度,見圖2。

圖2 包衣增重對胰酶釋放度的影響

由圖2可知,腸溶層包衣增重數(shù)值為25%時,胰酶在人工胃液中累計釋放量>10%,不符合要求;包衣增重為40%和45%時,胰酶在人工腸液中累計釋放量﹤70%,不符合要求;包衣增重為30%和35%時,胰酶累計釋放度滿足要求,考慮到成本和工藝,包衣增重定為30%。

增塑劑用量對胰酶累計釋放度影響:配制檸檬酸三乙酯用量分別為12%、16%和20%的腸溶層包衣液進行包衣,保持其他條件不變,按照2.4.3.1項下方法分別測定不同增塑劑用量的胰酶腸溶微丸中胰酶累計釋放度,見圖3。

圖3 不同增塑劑用量對胰酶累計釋放度的影響

由圖3可知,3種濃度的增塑劑都滿足條件,考慮到成本,故選擇增塑劑的用量為12%。

聚合物濃度對胰酶釋放度影響:配制聚合物濃度分別為5%,7.5%,10%,在其它條件不變情況下進行包衣。按照2.4.3.1項下方法分別測定不同聚合物濃度的胰酶腸溶微丸中胰酶累計釋放度,見圖4。

圖4 聚合物濃度對溶出度的影響

由圖4可知,聚合物濃度為5%時,胰酶在人工胃液中累計釋放度>10%,不符合要求;聚合物濃度為10%時,包衣液粘度大,包衣時微丸容易粘連在一起難以分開,進而影響腸溶衣的成膜性,導致不成膜且多孔,藥物釋放速度加快;聚合物濃度為7.5%時滿足要求,故選用聚合物濃度為7.5%。

腸溶層包衣液處方和工藝確定:通過腸溶層包衣液處方中各單因素考察,最后確定包衣處方和工藝為:聚合物濃度為7.5%,包衣增重為30%;檸檬酸三乙酯用量為12%;滑石粉適量。

處方和工藝驗證試驗:按上述腸溶層包衣液處方和工藝制備3批胰酶腸溶微丸,進行累計釋放度測定,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,3批胰酶腸溶微丸的釋藥速度無顯著性差異,說明制備處方和工藝重現(xiàn)性良好。

表5 三批樣品累計釋放度測定

2.5 不同指標下的釋放度考察

取140729批次的胰酶腸溶微丸,按照測定方法,用BCA蛋白濃度試劑盒、胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活力來計算累計釋放度[2],見圖5。

圖5 不同的方法表示胰酶腸溶微丸中胰酶的累計釋放度

由圖5可知,用BCA蛋白濃度法表示胰酶腸溶微丸累計釋放度時,數(shù)值要比胰脂肪酶活力表示的高一些,可能是制備過程中,機器產(chǎn)熱引起少量胰酶失活所致。胰蛋白酶活力太小,沒參考價值;胰脂肪酶活力和胰淀粉酶活力表示的溶出度基本一致,說明胰酶腸溶微丸中胰脂肪酶得到了抗酸保護。

3 討論

為避免胰脂肪酶在胃酸中失去活性,保證胰酶在腸道中釋藥的目的,本實驗選用Eudragit L30D-55聚合物水分散體作為腸衣材料使用[10]。該腸衣材料顯酸性(pH值約為4),直接對胰酶微丸進行包衣時,會使部分胰脂肪酶活力失去,因此考慮在包腸衣之前,先對胰酶微丸進行包隔離層。HPMC是最常用的隔離衣材料,顯中性,對胰酶活性無影響,與廉價的滑石粉配合使用,提高了包衣效率。

本實驗結(jié)果表明,制得外觀良好的胰酶微丸收率在90%左右,再進一步用含有滑石粉的HPMC混懸液進行包隔離液衣,當隔離衣厚度為10%時,有效地防止了腸衣對胰酶活力的破壞,最后用Eudragit L30 D-55聚合物水分散體包腸衣時,當腸衣增重為30%時,防止了胰酶腸溶微丸在胃中破壞,同時滿足了在腸中迅速釋放的要求,提高了胰酶腸溶微丸的穩(wěn)定性,保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。

由于胰脂肪酶活力會受到胃酸的影響會失活,選用胰脂肪酶活力來計算胰酶腸溶微丸中胰酶的累計釋放度,能更好地驗證腸溶制劑制備是否成功。此外,本實驗選用了BCA蛋白濃度法測定胰酶腸溶微丸中蛋白含量,可以判斷胰酶腸溶微丸在制備過程中是否失活,實驗結(jié)果表明,用離心式包衣制粒機在制備胰酶腸溶微丸時,胰酶有極少部分失活。原因是利用擠出滾圓制備微丸過程中,擠出篩孔與轉(zhuǎn)筒之間摩擦產(chǎn)熱,使得胰酶有一小部分失活,在后期工業(yè)化生產(chǎn)過程中,對機器工作產(chǎn)生的熱量要及時排除,可以考慮進一步安裝降溫裝置。