劉書遜，唐大海，賀嘉蕾，韓利華，劉曼嬌，吳　江

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·臨床醫(yī)學(xué)·

·論著·

航海條件下血液不同保存方法對(duì)紅細(xì)胞表達(dá)黏附分子的影響

劉書遜，唐大海，賀嘉蕾，韓利華，劉曼嬌，吳江

目的探討航海過程中血袋擺放方式對(duì)紅細(xì)胞表達(dá)黏附分子的影響。方法于出航訓(xùn)練當(dāng)日，采集4位健康志愿者全血，按常規(guī)方式制備紅細(xì)胞懸液，每份均分成4份，1份作為對(duì)照組保存在醫(yī)院輸血科冰箱，采用直立貼放方式，另3份作為實(shí)驗(yàn)組分別采用平鋪碼放、直立貼放、垂掛固定3種方式同置于艦載儲(chǔ)血冰箱。訓(xùn)練結(jié)束后，立即檢測送至實(shí)驗(yàn)室檢測紅細(xì)胞黏附分子CD58, CD44, CD47的表達(dá)。結(jié)果與陸地保存紅細(xì)胞比較，航海條件下艦載冰箱直立貼放保存的全血中紅細(xì)胞表達(dá)CD44和CD47的水平顯著升高，平鋪碼放保存的紅細(xì)胞表達(dá)CD58的水平顯著降低。結(jié)論從表達(dá)黏附分子角度，航海條件下，紅細(xì)胞適宜采用直立貼放方式保存于冰箱中。

船載運(yùn)輸；血液保存；紅細(xì)胞；黏附分子

找到適合于艦船上保存血液的條件是航海醫(yī)學(xué)面臨的一個(gè)新課題。航海時(shí)受波涌影響，放置于艦載冰箱中的全血實(shí)際上處于一種緩慢的、規(guī)律的振動(dòng)狀態(tài)，因此存放方式對(duì)紅細(xì)胞的影響可能會(huì)不同于陸地上血庫中的紅細(xì)胞。除了作為循環(huán)中唯一的供氧者，紅細(xì)胞通過供氧保證各組織臟器的正常生理功能，還作為一類免疫細(xì)胞與機(jī)體中的其他免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用[1-2]。已有的研究顯示，紅細(xì)胞通過表達(dá)多種黏附分子，與T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附并相互影響各自的功能[3-4]。筆者的另一項(xiàng)研究顯示，艦載冰箱中采用平放方式對(duì)紅細(xì)胞的滲透脆性和免疫黏附功能的影響較大，在本研究中筆者主要從紅細(xì)胞表達(dá)黏附分子(CD44，CD47，CD58)的角度探討不同艦載擺放方式對(duì)紅細(xì)胞的影響。

1　材料與方法

1.1血液采集與保存根據(jù)《獻(xiàn)血者健康檢查要求》(GB 18467-2011)，于出海訓(xùn)練前1 d、采集4名健康志愿者全血各200 ml(分別編號(hào)為a～d)，ACD抗凝。按常規(guī)方法制備紅細(xì)胞懸液各160 ml，密閉條件下平均分裝置4份血袋中，依次編號(hào)1～4。制備日，按常規(guī)血液儲(chǔ)存條件垂直貼放于輸血科專用儲(chǔ)血冰箱內(nèi)，各組1號(hào)作為陸地冰箱儲(chǔ)存對(duì)照組，其余于出發(fā)當(dāng)日冷鏈轉(zhuǎn)送至出海訓(xùn)練船只的專用冰箱中，各組2號(hào)采用垂直固定懸掛方式、3號(hào)采用直立貼合方式、4號(hào)采用平鋪碼放方式。任務(wù)結(jié)束當(dāng)日，同樣冷鏈轉(zhuǎn)送至輸血科實(shí)驗(yàn)室送檢。

1.2儀器與試劑FACS LSRII流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。熒光素偶聯(lián)的鼠抗人CD44-PE、CD47-PE、CD58-FITC單克隆抗體和同型對(duì)照抗體購自美國B.D. Pharmingen公司。

1.3航海條件2012年6月5-25日，任務(wù)船只隨“神舟九號(hào)”海上應(yīng)急救援保障編隊(duì)出航。航行21 d，航程5 000 n mile。期間，船只搖擺5度14 d，8度、9度各2 d，10度3 d，總計(jì)搖擺度5～10度，中位5度。海區(qū)浪高1.5 m 7 d，2 m 1 d，2～2.5 m 1 d，2.5 m 6 d，2.5～3 m 2 d，3 m及以上4 d，總計(jì)浪高在1.5～3 m，中位2.5 m。海況4～5級(jí)，其中5級(jí)5 d，4級(jí)16 d，中位4級(jí)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activating cell sorter,FACS)各組細(xì)胞先用預(yù)冷PBS配制1×106/ml的紅細(xì)胞懸液，分別加入終濃度為1 μg/ml熒光素偶聯(lián)的抗黏附分子抗體(CD58, CD44, CD47)或同型對(duì)照抗體(購自B.D.Pharmingen)，混勻后4℃放置15 min，再用PBS洗滌3次，重懸于300 μl PBS中，上機(jī)檢測(機(jī)型：B.D.FACS LSRII)，F(xiàn)ACSDiva軟件分析。黏附分子的表達(dá)以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算公式為：抗黏附分子抗體標(biāo)記的幾何平均熒光強(qiáng)度(geometric fluorescence intensity,GMI)/同型對(duì)照抗體標(biāo)記樣品的GMI。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以相對(duì)熒光強(qiáng)度和每組均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以GraphPad Prism軟件分析作圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1船載冰箱3種存放方式保存紅細(xì)胞表達(dá)CD44的水平與留存輸血科冰箱中的紅細(xì)胞比較，船載冰箱采用直立貼合放置方式(G2)保存的紅細(xì)胞表達(dá)CD44(P=0.036)明顯上調(diào)；采用垂直懸掛(G1)和平鋪碼放方式(G3)保存的紅細(xì)胞膜表面CD44的表達(dá)沒有發(fā)生顯著改變。見圖1。

注：A為各組中代表性CD44的表達(dá)(點(diǎn)圖)；B為各組所有樣本CD44表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，紅色顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.05圖1　不同船載冰箱存放方式對(duì)紅細(xì)胞表達(dá)CD44水平的影響

2.2船載冰箱3種存放方式保存紅細(xì)胞表達(dá)CD47的水平與留存輸血科冰箱中的紅細(xì)胞比較，船載冰箱采用直立貼合放置方式(G2)保存的紅細(xì)胞表達(dá)CD47(P=0.001)明顯上調(diào)；采用垂直懸掛(G1)和平鋪碼放方式(G3)保存的紅細(xì)胞膜表面CD47的表達(dá)沒有發(fā)生顯著改變。見圖2。

注：A為各組中代表性CD47的表達(dá)(點(diǎn)圖)；B為各組所有樣本CD47表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，紅色顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.01圖2　不同船載冰箱存放方式對(duì)紅細(xì)胞表達(dá)CD47水平的影響

2.3船載冰箱3種存放方式保存紅細(xì)胞表達(dá)CD58的水平與留存輸血科冰箱中的紅細(xì)胞比較，船載冰箱采用平鋪碼放方式(G3)直立貼合放置方式(G2)保存的紅細(xì)胞表達(dá)CD58(P=0.001)發(fā)生明顯下調(diào)；采用垂直懸掛(G1)和直立貼合放置方式(G2)保存的紅細(xì)胞膜表面CD58的表達(dá)沒有發(fā)生顯著改變。見圖3。

注：A為各組中代表性CD58的表達(dá)(點(diǎn)圖)；B為各組所有樣本CD58表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，紅色顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；G1～3為3種存放方式；aP<0.01圖3　不同船載冰箱存放方式對(duì)紅細(xì)胞表達(dá)CD58水平的影響

3　討論

紅細(xì)胞膜表面黏附分子，如CD44，CD47和CD58等的表達(dá)水平在一定程度上反映其衰老程度。有研究表明，儲(chǔ)存紅細(xì)胞表達(dá)的CD44分子，在28 d后，與年輕紅細(xì)胞相比會(huì)發(fā)生顯著性的下調(diào)[5]。在不含有白細(xì)胞的儲(chǔ)存血中，紅細(xì)胞表面的CD47和CD58在保存期不會(huì)發(fā)生明顯的改變，而在含有白細(xì)胞的儲(chǔ)存血液中，CD47和CD58的表達(dá)會(huì)迅速降低[5]。因此，通過儲(chǔ)存紅細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)可以判斷紅細(xì)胞的衰老情況，從而為研究儲(chǔ)存血液的方式提供一種檢測手段。

衰老紅細(xì)胞更容易被脾臟中的單核巨噬細(xì)胞吞噬清除，紅細(xì)胞膜表面的CD47分子的表達(dá)水平調(diào)控著紅細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的反應(yīng)性。CD47能夠結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)控蛋白α(SIRPα)，SIRPα是一種負(fù)向調(diào)控分子，其所轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能[6]。因此，低表達(dá)CD47的衰老紅細(xì)胞，因不能夠結(jié)合更多的SIRPα分子而使負(fù)向調(diào)控信號(hào)的強(qiáng)度較弱而更容易被巨噬細(xì)胞吞噬。艦載冰箱直立貼放方式保存的紅細(xì)胞在CD47分子的表達(dá)上明顯的高于陸地保存的紅細(xì)胞和其他兩種保存方式保存的紅細(xì)胞，說明這種方式更能夠延緩紅細(xì)胞的衰老。

CD44作為一種膜糖蛋白，表達(dá)廣泛，主要參與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，細(xì)胞黏附以及遷移等過程。CD44已知的大多數(shù)配體為細(xì)胞外基質(zhì)，包括透明質(zhì)酸、骨橋蛋白、膠原配體，此外還有基質(zhì)金屬蛋白酶。有研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜表面CD44能夠與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的未知配體相互作用，進(jìn)一步激活中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附[7]。這種效應(yīng)提示，在炎癥或者其他病理?xiàng)l件

下，紅細(xì)胞通過與這些細(xì)胞的相互作用促進(jìn)有可能促進(jìn)這些炎性細(xì)胞遷出血管外或者形成血栓。衰老紅細(xì)胞和長期保存的紅細(xì)胞的CD44表達(dá)下調(diào)，表明保存紅細(xì)胞在體內(nèi)的這種生理功能降低。因此，艦載冰箱直立貼放方式保存的紅細(xì)胞在CD44分子的表達(dá)上明顯的高于陸地保存的紅細(xì)胞和其他兩種保存方式保存的紅細(xì)胞，說明這種方式更能夠延緩紅細(xì)胞的衰老或者更接近生理?xiàng)l件下的紅細(xì)胞。

此外，船在冰箱中平鋪碼放保存的紅細(xì)胞CD58的表達(dá)顯著低于陸地保存紅細(xì)胞和其他兩種方式，說明這種方式不適合在航行過程中保存紅細(xì)胞。另一份通過檢測紅細(xì)胞滲透脆性和黏附功能的研究，也證實(shí)了這種方式的缺陷。鑒于垂直懸掛固定方式保存的紅細(xì)胞表達(dá)CD47的水平低于直立貼放方式，因此艦載冰箱直立方式更適于航海時(shí)的輸血貯存需要。

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(本文編輯：甘輝亮)

The expression of adherent molecules in the preservation of human red blood cells during deployment at sea

LiuShuxun,TangDahai,HeJialei,HanLihua,LiuManjiao,WuJiang

(DepartmentofImmunology&NationalKeyLaboratoryofMedicalImmunology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo investigate the effect of blood-bag placement mode in the refrigerator on the expression of adherent molecules in the preservation of human erythrocytes onboard the ship.Methods On the first day of deployment to sea, 4 blood samples were collected from 4 healthy volunteers. Erythrocyte suspension was equally aliquoted into four portions, one as the control group was placed vertically in the refrigerator of the hospital and the other three as the experiment group were preserved in the same refrigerator onboard the ship in 3 different placement modes (the layer-upon-layer mode, the upright mode and the vertical suspension mode). After completion of the training, the preserved samples were immediately sent to the laboratory for the detection of the expressions of CD47, CD58, and CD44.ResultsThe expression levels of CD44 and CD47 in the erythrocytes of whole blood placed on the shipboard refrigerator were significantly higher, as compared with those of the control group in the hospital. The expression levels of CD58 in the erythrocytes placed in the layer-upon-layer mode decreased significantly.ConclusionFrom the aspect of the expression of erythrocyte, the upright placement mode was most suitable for the preservation of blood in the shipboard refrigerator.

Shipboard blood transport; Blood preservation; Erythrocyte; Adherent molecule

國家自然科學(xué)基金(81172787，31470858)

單位]200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室(劉書遜)；解放軍第四一一醫(yī)院檢驗(yàn)科(唐大海、賀嘉蕾、韓利華、劉曼嬌)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院輸血科(吳江)

吳江，電子信箱：wujiang@renji.com

R82

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2016.04.016

2015-12-20)