李再新，唐文才（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

蜜環(huán)菌生長培養(yǎng)基的優(yōu)化及雜菌的分離鑒定

李再新，唐文才
（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

為提高蜜環(huán)菌產(chǎn)量，采用正交試驗法對蜜環(huán)菌生長培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母粉、維生素B13個組分的添加量進行優(yōu)化，利用平板法分離出影響蜜環(huán)菌生長的主要雜菌并采用分子生物學的方法對污染菌株進行鑒定。試驗結果表明：葡萄糖45 g/L、酵母粉9 g/L、維生素B10.05 g/L為最佳配方。分離出兩株霉菌，經(jīng)過鑒定，分別為橘青霉Penicillium citrinum t1、塔賓黑曲霉Aspergillus tubingensis t2。

蜜環(huán)菌；正交試驗；rDNA-ITS菌種鑒定；篩選

蜜環(huán)菌屬于擔子菌綱、傘菌目、真菌的一屬。名貴藥材天麻，豬苓的生長離不開蜜環(huán)菌，蜜環(huán)菌是天麻無性繁殖生長階段的物資基礎[1]。近年人們對天麻保健功能的不斷認識，天麻價格不斷上漲且其需求旺盛，種植面積快速擴張，據(jù)統(tǒng)計2012年天麻全國的總產(chǎn)量大概在2 000 t左右[2]。優(yōu)質天麻的生長主要在海拔1 500 m～3 000 m的偏遠高寒山區(qū)，山區(qū)種植資源狹窄，種植技術落后，長期處于貧困狀態(tài)，因此天麻的栽培是山區(qū)人們致富的重要途徑。天麻對蜜環(huán)菌具有寄生關系，蜜環(huán)菌的健壯生長是高品質天麻栽培的基本條件，但在天麻栽培過程中蜜環(huán)菌主要以闊葉樹木的木塊為原料，積累營養(yǎng)，為天麻的生長提供養(yǎng)料[3]，同時蜜環(huán)菌生長固體瓊脂糖平板培養(yǎng)基也需要用木塊的浸提液配制，這種培養(yǎng)基成分也非常適合木霉和青霉菌等雜菌的生長而且比蜜環(huán)菌生長更快，因此在蜜環(huán)菌的培養(yǎng)中木霉和青霉污染對蜜環(huán)菌的純培養(yǎng)形成了巨大的威脅，也降低了在栽培過程中蜜環(huán)菌對有限木材的利用率，嚴重影響了天麻的產(chǎn)量和品質[4]。本研究旨在對蜜環(huán)菌生長所需要的條件進行優(yōu)化，并對污染蜜環(huán)菌純種培養(yǎng)的菌進行分離鑒定，對以后蜜環(huán)菌培養(yǎng)基中雜菌專一抑制劑的篩選奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1菌種

蜜環(huán)菌：由昭通天麻生產(chǎn)基地提供。

1.2培養(yǎng)基

蜜環(huán)菌培養(yǎng)基：瓊脂15 g/L，馬鈴薯200 g/L，K2HPO43 g/L，MgS041.5 g/L，葡萄糖45 g/L，維生素B10.05 g/L，酵母粉3 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3主要儀器

D3024臺式高速微量（冷凍型）離心機：大龍創(chuàng)新實驗儀器（北京）有限公司；BD-30生物顯微鏡：深圳市博視達光學儀器有限公司；GZ-250-HSH恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司。

1.2方法

1.2.1蜜環(huán)菌生長培養(yǎng)基的優(yōu)化

切取約0.5 cm3大小的供試菌株菌塊接種于裝有20 mL加富型固體PDA瓶裝培養(yǎng)基中。25℃恒溫培養(yǎng)30 d。待培養(yǎng)基內長滿白色粗壯菌索后待用。

參考彭述敏等[5]、程顯好等[6]的單因素營養(yǎng)條件篩選結果，選取葡萄糖，酵母浸粉和維生素B1作為研究因素。設計三因素三水平的正交試驗，見表1。

表1　L9（34）正交試驗的因素及水平Table 1　The factors and levels of L9（34）orthogonalexperimen

按表1進行試驗，每個試驗號做3個平行。滅菌后每20 mL培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm培養(yǎng)瓶中。每一個培養(yǎng)瓶中接種約1 cm3的蜜環(huán)菌菌種塊。在裝液量為20 mL/瓶（直徑為9 cm的培養(yǎng)瓶），接種量為1 cm3/瓶，溫度為25℃，恒溫培養(yǎng)13 d后測定蜜環(huán)菌干重。

1.2.2密環(huán)菌培養(yǎng)基中雜菌的分離

從被雜菌污染的密環(huán)菌培養(yǎng)基中挑取雜菌菌斑，在無菌條件下，接種到盛有25 mL無菌生理鹽水中，在150 r/min、30℃條件下振蕩30 min，再以無菌生理鹽水進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋，分別取各梯度稀釋液0.1 mL涂布于含有100 mg/mL頭孢霉素以及10滴/L的25%乳酸的PDA培養(yǎng)基上，同時做平行和空白對照，然后在28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)3 d。挑取優(yōu)勢單菌落純化（劃線3次以上）后接種到試管斜面于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹7-10]。

1.2.3形態(tài)學特征鑒定

將篩選得到的菌株接種到加富PDA培養(yǎng)基上，28℃插片培養(yǎng)3、5、7、15 d后，通過光學顯微鏡分別觀察氣生菌絲及基內菌絲發(fā)育情況[11-13]。

1.2.4雜菌基因組DNA的提取及rDNA-ITS菌種鑒定

采用CTAB法提取菌絲體基因組總DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測，再用紫外分光光度計定量檢測[14]。

采用rDNA-ITS序列分析技術對雜菌進行分子鑒定。采用rDNA-ITS的PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10 mmol/L dNTPs 2μL，25 mmol/L MgCl22μL，5 U/μL Taq DNA酶0.3μL，10μmol/L ITS5/ITS4引物各1μL，17 ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O 14.2μL，反應總體積為25μL。94℃預變性1 min后；92℃變性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后于72℃補平5 min，終止溫度為4℃。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測rDNA-ITS的PCR擴增產(chǎn)物，用凝膠圖像分析儀攝取擴增圖譜。然后用DNA凝膠回收試劑盒從1.2%的瓊脂糖凝膠中回收ITS的PCR擴增片段，并用DNA/RNA紫外分光光度計（GeneQuant Pro，GE Healthcare公司）檢測濃度。將擴增后的DNA送往上海杰李生物有限公司測序，測序結果進行BLAST比對及構建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株分類[15-16]。

2　結果及分析

2.1正交試驗結果

正交試驗結果及結果分析見表2、表3。

表3顯示，在蜜環(huán)菌培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗中，極差RA>RC>RB，所以影響蜜環(huán)菌菌索生長因素的主次順序為A（葡萄糖）、C（維生素B1）、B（酵母粉）。方差分析結果（表3）顯示葡萄糖的含量對菌索的生長影響顯著。

表2　L9（34）正交試驗結果Table 2　The resultoforthogonalexperiment

表3　方差分析結果Table 3　The analysis ofvariance

由表2可知，蜜環(huán)菌菌株生長的最優(yōu)方案為A3B3C1。方差分析結果顯示僅葡萄糖對蜜環(huán)菌菌索生長具有顯著影響，且顯著性影響：A>C>B，因此蜜環(huán)菌菌索生長培養(yǎng)基的最佳配方為A3B3C1。

2.2雜菌分離結果

通過平板法從30瓶被污染的蜜環(huán)菌培養(yǎng)基中篩選得到了兩種比較常見的雜菌，分別命名為t1和t2，結果見圖1。

圖1　蜜環(huán)菌培養(yǎng)基中雜菌的固態(tài)培養(yǎng)特征Fig.1　The characteristics ofmixed bacteria in the solid state culture of armillaria medium

2.3雜菌形態(tài)學特征鑒定結果

將菌株t1，t2通過劃線的方法接種到加富PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d察菌落形態(tài)，再采用插片法培養(yǎng)7 d，顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，結果見圖2。

圖2　雜菌顯微鏡下觀察特征Fig.2　Microscope characteristics of miscellaneous bacteria

在加富PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5 d后，觀察到菌落并在顯微鏡下觀察菌絲體。t1形態(tài)學鑒定：菌落絨狀，厚實，中央呈淺灰綠色，反面為暗黃色，表面有顆粒狀物質，具有放射狀皺紋。顯微鏡下觀察菌絲有橫隔，分生孢子梗頂端不膨大，無頂囊，經(jīng)多次分支產(chǎn)生對稱或不對稱的小梗，梗頂端產(chǎn)生成串的青色分生孢子。

t2形態(tài)學鑒定：菌落為暗黑褐色，粉末狀，稍有放射狀溝紋，反面顏色為黃褐色。顯微鏡觀察分生孢子的頂囊為球形或近球形，小梗雙層，第一層粗大，第二層短小，呈放射狀排列，布滿整個頂囊，黑色，頂端有鏈形孢子。

通過形態(tài)學特征可以初步判定t1為青霉，t2為黑曲霉。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株t1、t2的18SrDNA進行擴增，擴增結果見圖3。

圖3　PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3　The electrophoresis of PCR products

擴增后后測序，結果在NCBI上進行Blast同源性比對，比對結果顯示t1與Penicillium citrinum MSSRFIS1﹙HQ232482.1﹚相似度為99%，t2與Aspergillus tub－ingensis F4-0（JN561261.1）相似度為99%。根據(jù)比對結果篩選出相似度較高（>97%）的16SrDNA序列，以Clustal軟件進行序列比對，采用Neighbor-Joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4、圖5。

圖4　采用Neighbor-Joining（NJ）法構建t1的16SrDNA系統(tǒng)進化樹Fig.4　Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16SrDNA sequence alignment oft1

圖5　采用Neighbor-Joining（NJ）法構建t2的16SrDNA系統(tǒng)進化樹Fig.5　Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16SrDNA sequence alignmentof t2

由圖4、圖5可知，菌株t1與Penicillium citrinum MSSRF-IS1﹙HQ232482.1﹚處于同一聚類分支上，且分支置信度為65%，可以確定菌株t1屬于桔青霉屬，將該菌株命名為Penicillium citrinum t1。菌株t2與Aspergillus tubingensis F4-04（JN561261.1）處于同一聚類分支上，且分支

置信度為65%，菌株t2屬于黑曲霉屬，將其命名為Aspergillus tubingensis t2。

3　結論

蜜環(huán)菌是天麻無性繁殖生長階段的關鍵因素，蜜環(huán)菌的生長與天麻產(chǎn)量息息相關，本對蜜環(huán)菌的生長培養(yǎng)基優(yōu)化結果表明：葡萄糖45 g/L、酵母粉9 g/L、維生素B1為0.05 g/L最適宜蜜環(huán)菌的生長。對影響蜜環(huán)菌生長的雜菌的分離及鑒定結果表明：影響蜜環(huán)菌生長的主要菌株為黑曲霉和青霉。

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Armillaria Growth Medium Optimization and the Separation of Mixed Bacteria Identification

LIZai-xin，TANG Wen-cai
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to improve the yield of Armillaria，glucose，yeast powder，vitamin B1three components were optimized by the method of orthogonal experiment.The end of plate method was used to isolate the main bacterial and affect the growth of Armillaria strains of pollution by using molecular biology method.The results showed that the glucose 45 g/L，yeast powder 9 g/L，vitamin B10.05 g/L as the best formula.Two strains of the mold were isolated and identified，the results showed thatthe one was Penicillium citrinum t1，the other was Aspergillus tubingensis t2.

Armillaria；the orthogonalexperiment；rDNA-ITS strain identification；screening

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.036

李再新（1972—），男（漢），教授，博士，主要從事生物制藥方面的研究。

2015-06-04