孫魯龍，宋偉，翟衡*（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

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葡萄葉片上冰核細菌的分離鑒定

孫魯龍，宋偉，翟衡*
（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

摘 要：為了檢測葡萄上冰核活性細菌的分布情況，并探究其對葡萄葉片霜凍害的影響，本試驗對葡萄葉片上的冰核活性細菌進行了分離、鑒定和冰核活性的測定，并檢驗了活性較高的菌株對葉片凍害的效果。試驗通過分離共獲得10株冰核活性細菌，活性較高的1、2號菌株都是假單孢菌屬（Pseudomonas）。用1、2號菌處理葡萄葉片，進行霜凍脅迫，葉片的霜凍指數(shù)分別達到83.67%和90.42%，而對照組為66.13%；活性最好的2號菌可以提高葉片過冷點2.3 ℃。

關鍵詞：葡萄；冰核活性細菌；分離；鑒定；霜凍

近年來國內(nèi)葡萄酒市場的繁榮態(tài)勢，帶動了釀酒葡萄種植業(yè)的迅速發(fā)展。釀酒葡萄種植面積不斷擴大，分布區(qū)域逐漸北移。我國屬于典型的大陸性季風氣候，多數(shù)葡萄種植區(qū)春季氣溫并不像歐洲海洋性氣候那樣穩(wěn)定，這使得葡萄在萌芽期極易遭受晚霜凍的傷害。研究霜凍發(fā)生的影響要素，探索霜凍發(fā)生規(guī)律，開發(fā)高效防霜技術成為葡萄生產(chǎn)中的重要措施。一般認為，霜凍害的發(fā)生情況與植物的耐寒能力和低溫程度有關，霜凍被認為是一種氣象災害。近年的研究發(fā)現(xiàn)，某些微生物能加重植物的霜凍害。這些微生物能分泌特定的蛋白質(zhì)，為冰晶的形成提供必要的凝結(jié)核（冰核），使組織中的水在較高的低溫條件下發(fā)生胞內(nèi)或胞外結(jié)冰，從而加重低溫傷害。這類具有冰核活性的微生物被稱為冰核微生物，根據(jù)其種類不同分為冰核細菌和冰核真菌［1-2］，其中以冰核細菌的分布最為廣泛，對植物的影響也最顯著［3］。目前已經(jīng)在香蕉、草莓、杏、茶樹、小麥、枇杷等［4-9］多種作物上分離到了冰核細菌，但葡萄上冰核活性細菌的存在情況未見報道，冰核細菌對葡萄霜凍害的影響也是未知數(shù)。本研究旨在探明葡萄上冰核細菌的種類，并研究其對葡萄嫩葉霜凍害的影響，為防治霜凍提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 冰核細菌的分離

從2012-2014年，每年春季于葡萄萌芽期采集嫩葉作為分離冰核細菌的樣品。采樣時間為清晨，采樣地點為本學院實驗站葡萄園、蓬萊國賓酒莊葡萄園。采樣時戴上一次性無菌乳膠手套，將陽光未照射到的葉片摘下［10］，收集到潔凈的自封袋中，放入冰盒帶回實驗室。

嫩葉樣品立即采用平板涂布法［11］分離細菌，若不能立即分離，暫時保存在4 ℃冰箱里，并在1～3 d內(nèi)完成分離工作。在超凈工作臺上用無菌剪刀將樣品剪碎混勻，隨機稱取1 g放入無菌研缽中，加入少量滅菌的石英砂充分研磨，用含0.1%蛋白胨的無菌水定容到10 mL，在200 r/min 25 ℃處理1 h，靜置5 min。取1 mL上清液進行10倍系列梯度稀釋，從10-3、10-4、10-53個稀釋度中分別吸取0.1 mL稀釋液涂布在各種培養(yǎng)基上，18 ℃培養(yǎng)3～5 d，長出的菌落根據(jù)形狀、顏色、大小、邊緣及表面特性等性狀初步分類，并采用各自的分離培養(yǎng)基劃線純化至沒有雜菌。

采用小液滴凍結(jié)法［12-13］檢驗菌株冰核活性的有無并測定其活性的強弱。在超凈工作臺上挑取長出的各種菌落，接種在KB平板上，24 ℃培養(yǎng)72 h。用超純水沖洗菌苔，調(diào)整菌液濃度約108cfu/mL（用KB平板計數(shù)），4 ℃處理5 h，作為冰核活性測試液。按照文獻提供的方法［10］，在不超過20 ℃的環(huán)境溫度下，以超純水為對照，測定每個菌株108cfu/mL菌液在-5 ℃下5 min內(nèi)的10滴液滴的凍滴率，每個重復有20%以上小液滴結(jié)冰認為該菌株具有冰核活性，試驗重復3次。篩選出來的冰核細菌接種到KB斜面上，在24 ℃培養(yǎng)48 h后保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用。

試驗用培養(yǎng)基［11］：

（1）甘油酪朊水解物培養(yǎng)基。甘油10 mL，酪蛋白水解物1 g，Na2HPO42.3 g，蔗糖10 g，NH4Cl 5 g，十二烷基硫酸鈉0.6 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌15 min。

（2）蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基。蔗糖20 g，蛋白胨5 g， K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌15 min。

（3）歐文氏菌選擇性培養(yǎng)基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，甘油25 mL，NaCl 50 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2，121 ℃滅菌15 min。

（4）KB培養(yǎng)基。蛋白胨20 g，甘油25 mL［14］，K2HPO41.5 g，MgSO41.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2，121 ℃滅菌15 min。

1.2 冰核細菌對葉片霜凍害的影響

1.2.1 葡萄幼苗培養(yǎng)

試材為美樂1年生扦插苗，當幼苗長出10片功能葉時，選取長勢一致的苗木進行試驗。苗木培養(yǎng)環(huán)境為晝/夜溫度25 ℃/20 ℃，600～800 μmoL/（m2·s）光強，空氣相對濕度70%～75%。

1.2.2 菌液準備

各菌株接種在KB培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)3 d，用無菌水沖洗菌苔，調(diào)整菌液濃度至108cfu/mL，放在4 ℃冰箱備用。

1.2.3 降溫處理［15］

設置清水對照和噴布菌液兩個處理。處理后在暗處晾干，將每個處理的幼苗各30株搬到人工氣候箱內(nèi)，模擬自然界霜凍降溫天氣，按19 ℃/h速度從室溫降至4 ℃，再以2 ℃/h降至-3 ℃，維持4 h，之后以3 ℃/h速度回溫到25 ℃，24 h后觀察葉片的霜凍情況，霜凍指數(shù)/%=每棵幼苗受凍葉片數(shù)/每棵幼苗總?cè)~片數(shù)×100。

將熱電偶固定在第3片葉上，以2 ℃/h速度繼續(xù)降溫，直到監(jiān)測的電壓信號陡增，將電壓信號陡增的溫度點作為過冷點。

1.3 冰核細菌的分子鑒定

1.3.1 引物設計

根據(jù)黃曉琴［16］的方法設計通用引物，送北京金唯智生物科技有限公司進行引物合成。

1.3.2 菌落PCR［17-20］

前處理：挑取少量菌落，充分溶解在1 mL無菌水中，沸水煮15 min。

建立反應體系：ddH2O 10 μL，2×Taq Master Mix 8 μL，引物1 μL，菌液1 μL，總體積10 μL。

擴增條件：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應。

擴增后取7 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查產(chǎn)物的特異性，特異性好的切膠回收，并送北京華大基因科技有限公司測序。

1.3.3 菌株同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比對，并選擇Gene bank中同源性較高的菌株序列與測試菌株進行比對，確定待測菌株的分類地位，同時用CLUSTAL 1.8.3和MEGA 5.2進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰核細菌的分離情況

本試驗獲得了10株具有冰核活性的細菌，如表1所示。其中6株分離自蓬萊國賓酒莊葡萄基地，另外4株分離自泰安市山東農(nóng)業(yè)大學試驗站葡萄園。1號、2號菌在-5 ℃測試環(huán)境下凍滴率可以達到100%，是所有菌株中冰核活性最強的菌株。分離自蓬萊地區(qū)的冰核細菌（1～6號）凍滴率最高為100%，最低為40%，平均為78.3%；分離自泰安地區(qū)的冰核細菌凍滴率最高為60%，最低為30%，平均為42.5%。從本試驗結(jié)果看，泰安地區(qū)的冰核細菌冰核活性要小于蓬萊地區(qū)的。

表1 具有冰核活性的菌株

2.2 冰核細菌對葡萄葉片霜凍害的影響

冰核細菌對植物而言，最大的危害在于能誘發(fā)和加重植物遭受霜凍害。表2顯示了不同冰核細菌菌株噴布到葡萄葉片上后，進行霜凍處理，葉片霜凍遭受霜凍傷害的程度。從表2可以看出，與對照相比，冰核細菌能升高葉片的過冷點，增加霜凍指數(shù)。但不同的冰核細菌其致害效果不同。分離自蓬萊地區(qū)的1～6號菌，過冷點相對較高，造成葉片的霜凍指數(shù)也較高，1～5號處理后葉片的過冷點和霜凍指數(shù)要顯著高于對照，其中2號菌的致害效果最明顯，用其處理葉片，葉片的過冷點為-4.458 ℃，相對于對照的-6.768 ℃升高了2.3 ℃左右，同時造成葉片霜凍指數(shù)達到90.42%，較對照顯著提升了34%。分離自泰安的4株冰核細菌，只有10號的作用效果與對照相比有顯著差別，使葉片過冷點提高了0.7 ℃左右，霜凍指數(shù)增加了10%左右。

表2 冰核細菌對葉片霜凍的影響

2.3 冰核細菌的同源性分析

將10株冰核細菌測得的16S rDNA序列在NCBI上進行Blast比對發(fā)現(xiàn)，10個菌株分別與已經(jīng)發(fā)表的10種菌具有99%以上的相似性，如表3所示。分離到的冰核細菌大部分屬于假單胞菌屬。

2.4 冰核細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

用CLUSTAL 1.83軟件進行多重序列比較后，再用MEGA5.2 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)2、4、5號菌可以聚合在一起，3、10號菌可以聚合在一起，說明其彼此之間起源較近。初步將各菌株確定為1、2、4、9是Pseudomonas sp.中的菌株，3、10是Pseudomonas fluorescens中的菌株，5號為Agrobacterium中的菌株，6號為Staphylococcus中的菌株，7號為Brevibacterium中的菌株，8號為Microbacterium中的菌株。

3 討論與結(jié)論

表3 待測菌株的序列比對結(jié)果

冰核活性細菌影響植物對低溫的敏感性及反應已經(jīng)得到了大量的驗證，在果樹方面也取得了一些研究進展，但是在葡萄領域還未見報道，因此，本試驗對葡萄上的冰核活性細菌進行分離鑒定并研究其對葡萄霜凍害發(fā)生的影響具有重要意義。

圖1 10株菌的系統(tǒng)進化樹

試驗獲得10株具有冰核活性的細菌，經(jīng)鑒定大部分為假單孢菌屬，同時也發(fā)現(xiàn)，未在文獻中報道的其他細菌也具有一定的冰核活性。但后續(xù)的霜凍試驗發(fā)現(xiàn)，只有1、2、3、4、5、10號菌能較大幅度增加葉片的過冷點和霜凍指數(shù)，另外4株并未造成顯著的影響。這說明，細菌具有冰核活性和能造成霜凍傷害并不完全等同。細菌的冰核活性通常被認為來自冰核蛋白，而冰核只要求成核物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與水分子結(jié)構(gòu)相似，在降溫過程中可以使冰晶有序排列即可，因此冰核蛋白可能并不是唯一的有機態(tài)冰晶排列模板。如果細菌自身的結(jié)構(gòu)也可以滿足成核要求，則會有不少細菌具有冰核活性。但是冰核細菌要對葉片造成霜凍影響，就必須產(chǎn)生冰核蛋白，進入寄主細胞，或者錨定在寄主細胞膜上，通過凝核結(jié)冰的效果破壞膜的完整性，以造成傷害。冰核細菌具有冰核活性但不一定能誘發(fā)和加重霜凍害的現(xiàn)象需要進一步的研究。

在10株菌中，1號和2號菌冰核活性最高、致害效果最好，造成葉片的過冷點大約在-4.5～-5 ℃之間。在自然環(huán)境下，冰核細菌的種群密度很難達到試驗室環(huán)境下的高濃度（108cfu/mL），因此本研究初步認為，雖然葡萄上的某些冰核細菌（如2號）具有一定的冰核活性，但葡萄上的冰核細菌可能并不是誘發(fā)和加重霜凍的主要因素。

在研究中發(fā)現(xiàn)，蓬萊較泰安分離到的冰核細菌數(shù)目多、活性強，說明沿海的氣候環(huán)境可能更適合冰核細菌的生長，冰核細菌的存在及活性表達可能需要特定的溫濕環(huán)境。由于大陸性季風氣候的影響，我國的葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄春季萌芽期多具有干旱、多風的特點，這種氣候并不適合冰核細菌的生長，因此會進一步削弱冰核細菌的致害效果。因此，冰核細菌對葡萄霜凍的影響仍有待于進一步研究。

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中圖分類號：S663.1

文獻標識碼：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.04.001

收稿日期：2016-03-10

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設專項資金項目（CARS-30）；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目（IRT15R42）

作者簡介：孫魯龍（1987-），男，在讀博士，主要從事葡萄抗寒生理研究。E-mail: lulongsun@126.com

*通訊作者：翟衡，E-mail: zhaih@sdau.edu.cn

Isolation and identification of ice nucleation active bacteria from leaves of grapevine

SUN Lulong， SONG Wei， ZHAI Heng*
（State Key Laboratory of Crop Biology， College of Horticultural Science and Engineering，Shandong Agricultural University， Tai'an 271018， Shandong， China）

Abstract:To investigate the distribution of ice nucleation active bacteria in grapevine and detect its influence on frost damage of leaf， ice nucleation active bacteria were isolated and identified from leaves of grapevine.Effects of frost damage on leaves induced by strains with high ice nucleation activity were examined.10 strains of ice nucleation active bacteria were obtained， the most active strains NO.1 and NO.2 belonged to Pseudomonas.Frost index of leaves reached 83.67% and 90.42% after sprayed by NO.1 and NO.2 strains separately， while the control group was 66.13%.The most active strain was NO.2， raising 2.3 ℃ of leaf supercoiling temperature.

Key words:grapevine； ice nucleation active bacteria； isolation； identification； frost