王洲羿　　周　剛　　肖展翅　　甘小莉　　李　鋼　　高　聚　　倪小紅　　陳浩特

黃岡市中心醫(yī)院，湖北黃岡　438000

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·實(shí)驗(yàn)研究·

丹紅注射液對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的研究*

王洲羿周剛肖展翅甘小莉李鋼高聚倪小紅陳浩特△

黃岡市中心醫(yī)院，湖北黃岡438000

摘要目的探討丹紅注射液對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法篩選造模成功的VD大鼠隨機(jī)分為治療組和VD模型組，每組12只大鼠，另有12只正常組、12只假手術(shù)組。治療組給予丹紅注射液腹腔注射給藥；同時(shí)正常組、假手術(shù)組、VD模型組分別腹腔注射生理鹽水。28 d治療結(jié)束后各組大鼠開始做行為學(xué)測(cè)試，行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，行免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果與VD模型組相比，治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組與VD模型組大鼠海馬區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組與正常組，而治療組與VD模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)增加的幅度明顯大于Bax蛋白(P<0.05)。結(jié)論丹紅注射液通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能力。

關(guān)鍵詞丹紅注射液；血管性癡呆；細(xì)胞凋亡

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由腦血管危險(xiǎn)因素(如高血壓、糖尿病、高脂血癥等)明顯(如腦卒中)或不明顯(如腦白質(zhì)疏松和慢性腦缺血)的腦血管病而導(dǎo)致的從輕度認(rèn)知障礙到癡呆的一大類綜合征。目前隨著社會(huì)人口的老齡化，腦血管疾病的發(fā)病率在逐年上升[1]，而由于腦血管疾病的高發(fā)病率，在導(dǎo)致癡呆的眾多病因中，VD是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的第二大病因[2]。因此，VD的研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，VD具有潛在的可防治性，被稱為“可逆性癡呆”，此病尚缺乏有效的藥物治療。VD屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，血瘀是血管性癡呆的重要病理因素之一。丹紅注射液由丹參、紅花提取后制成，具有活血化瘀，通脈舒絡(luò)的作用。本研究擬建立VD大鼠模型，通過丹紅注射液對(duì)模型大鼠的治療，從其行為學(xué)和分子生物學(xué)水平分析VD大鼠發(fā)病機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)，探索和建立中醫(yī)藥防治血管性癡呆的研究模式，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與受試藥物

SD大鼠80只，SPF級(jí)，體重(200±20)g，雌雄各40只，湖北省黃岡市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠購(gòu)買后，養(yǎng)殖于自然光線下，保持溫度20～25 ℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。受試藥物丹紅注射液(濟(jì)南步長(zhǎng)制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)15092002)。

1.2儀器與試劑

MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；熒光多功能顯微鏡(BX，日本OLYMPUS公司)；CMIAS圖像分析儀(CMIAS 98A，北京航空航天大學(xué))；石蠟切片機(jī)(RM2145，德國(guó)LEICA公司)；Image-pro plus圖像處理系統(tǒng)6.0(美國(guó)MEDIA CYBERNETICS公司)。免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3．1VD大鼠的造模方法采用反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)造成缺血再灌注損傷(2VO)建立大鼠VD模型[3]。采用10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，鈍性分離雙側(cè)CCA，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA，造成腦缺血，夾閉10 min，再灌注20 min，反復(fù)3 次，縫合切口，術(shù)后行抗感染治療。假手術(shù)組只行CCA分離，不夾閉血管。

1.3.2分組與給藥經(jīng)水迷宮檢測(cè)證實(shí)VD模型制作成功大鼠24只，隨機(jī)分為治療組及VD模型組，每組12只大鼠，另有12只正常組、12只假手術(shù)組。造模成功后治療組按成人臨床等效量進(jìn)行換算，丹紅注射液劑量為4 ml/(kg·d)(相當(dāng)于成人用藥量的7倍)腹腔注射給藥；同時(shí)正常組、假手術(shù)組、VD模型組均按照1.5 ml/100 (g·d)分別腹腔注射生理鹽水。以上各組大鼠1周稱1次鼠重，并調(diào)整給藥劑量，連續(xù)腹腔注射28 d。

1.3.3學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定采用Morris水迷宮方法[4]。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放入水中進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。術(shù)后28 d各組大鼠開始行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)5 d，每天4次，大鼠面向池壁從A、B、C、D入水點(diǎn)放入水中，觀察其在2 min內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，若2 min未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將其牽引至平臺(tái)上，停留10 s后放回籠中，潛伏期計(jì)為最高分2 min；②空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)放入大鼠，測(cè)量2 min內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限和其他象限的游泳時(shí)間和穿越目標(biāo)(原平臺(tái))次數(shù)[5]。

1.3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞的表達(dá)行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，各組大鼠行心臟灌注術(shù)，以0.4%的戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟。左心室迅速插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心室，灌注生理鹽水，速度先快后慢，直至舌尖、肝臟變白，大鼠四肢僵硬為滿意，迅速取腦，立即將腦置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h，取視交叉后側(cè)處至小腦前的腦組織，PBS漂洗，經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 mm厚切片，行免疫組化染色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1丹紅注射液對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響

2.1.1定位航行實(shí)驗(yàn)隨著訓(xùn)練次數(shù)增多，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短。與正常組、假手術(shù)組相比，VD模型組、治療組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；而與VD模型組相比，治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.1.2空間探索實(shí)驗(yàn)與正常組、假手術(shù)組相比，VD模型穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與VD模型組相比，治療組穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1　各組大鼠逃避潛伏期比較

與正常組、假手術(shù)組比較##P<0.01；與VD模型組比較*P<0.05

表2各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

組別穿越目標(biāo)象限時(shí)間(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)正常組30.04±6.6411.25±2.05假手術(shù)組28.78±7.8510.66±2.10VD模型組12.15±5.76##3.85±0.85##治療組16.22±4.58*5.25±1.64*

與正常組、假手術(shù)組比較##P<0.01；與VD模型組比較*P<0.05

2.2各組大鼠海馬Bcl-2、Bax免疫組化結(jié)果

正常組與假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)，可見少量凋亡細(xì)胞表達(dá)，與正常組、假手術(shù)組相比，VD模型組海馬區(qū)凋亡細(xì)胞增多(P<0.01)；與VD模型組比較，治療組海馬區(qū)凋亡細(xì)胞減少(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠海馬Bcl-2、Bax免疫組化結(jié)果

與正常組、假手術(shù)組比較##P<0.01；與VD模型組比較*P<0.05

3討論

在缺血缺氧過程中，某些腦區(qū)較其他部位更容易受到損傷，這些易損傷區(qū)近來被稱之為選擇性敏感區(qū)。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)中參與學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)，其中海馬CAl區(qū)是信息加工、整合、強(qiáng)化、傳遞的重要區(qū)域，海馬CA1區(qū)是海馬結(jié)構(gòu)中與人類學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的功能區(qū)，具有對(duì)缺血的選擇易損傷[6]?？赡茉赩D的發(fā)病過程中具有重要的作用[7]。

VD屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，多因年高體虛，臟腑功能失調(diào)，氣血虧損，痰阻血瘀所致。其病位在腦，其本在于心肝脾腎的功能失調(diào)；其標(biāo)在于痰濁、瘀血，蒙閉清竅，致神機(jī)失用。相關(guān)研究[8]表明血管性癡呆患者的臨床辨證多屬痰瘀互結(jié)，并指出氣滯血瘀是血管性癡呆的基本病機(jī)。頭為精明之府，若血脈不和，氣血逆亂，內(nèi)風(fēng)卒中致腦府受損，瘀阻髓絡(luò)，腦脈不通，髓海與各臟氣不相順接，五臟精氣不能上榮于“元神之府”，從而出現(xiàn)呆傻愚笨諸癥。誠(chéng)如《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》所云：“血之注于腦者過少，無以養(yǎng)其腦髓神經(jīng)，其腦髓神經(jīng)亦恒至失其所司”。《醫(yī)林改錯(cuò)》提出：“凡有瘀血也，令人善忘”，認(rèn)為是由于“氣血凝滯腦氣，與臟腑之氣不相接”而致癡呆。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程[9]，Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子，Bcl-2、Bax是這一家族中重要成員。其根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為凋亡抑制因子和促凋亡誘導(dǎo)因子，其中Bcl-2是最主要的凋亡抑制因子，而Bax是最主要的凋亡促進(jìn)因子[10]。Bcl-2基因是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子，過度表達(dá)后可抑制由于氧自由基、興奮性氨基酸等誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bax為重要促凋亡基因，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是Bax同源二聚體的形成，Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用則要通過與Bax結(jié)合形成異源二聚體來實(shí)現(xiàn)[11]。

丹紅注射液由丹參及紅花2味活血化瘀中藥組成。丹參味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，通血脈、散瘀結(jié)，為主藥；紅花味辛，性溫，歸心、肝經(jīng)，化瘀血、通經(jīng)絡(luò)，為輔藥，二藥相輔除邪不傷正，共奏活血通絡(luò)、祛瘀生新之功，臨床上廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的預(yù)防與治療。丹參的主要有效成分包括丹參酮、丹參酚酸，丹參酮具有可抑制磷酸二酯酶，升高紅細(xì)胞、血小板、環(huán)磷酸腺苷(cAMP) 濃度，興奮前列環(huán)素( PGI2)合成酶的活性，使血管擴(kuò)張，它還是強(qiáng)抗氧化劑，能有效清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定細(xì)胞膜，丹參酚酸有較強(qiáng)的抗血小板聚集作用，可以顯著降低血漿的TXB2水平，從而具有防栓、抗拴、提高腦灌注功效[12-13]；紅花的主要活性成分紅花黃色素，具有抑制血小板凝集；提高血漿纖溶酶原激活劑的活性，延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間和凝血時(shí)間，降低血壓和膽固醇，改善腦組織的微循環(huán)障礙，提高體內(nèi)一氧化氮(NO)水平，清除氧自由基、保護(hù)線粒體、抑制鈣離子內(nèi)流、有效改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)的作用[14-16]。前期大量基礎(chǔ)與臨床試驗(yàn)已證明丹紅注射液治療冠心病、腦梗死等缺血性疾病的有效性與安全性。

有學(xué)者[17-19]報(bào)道丹紅注射液可較為明顯地改善缺血性腦卒中后患者的認(rèn)知功能和日常生活能力。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后28 d VD模型大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為逃離潛伏期的延長(zhǎng)和在目標(biāo)象限中游泳時(shí)間的縮短以及穿越平臺(tái)次數(shù)的減少，而與VD模型組相比，治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，本實(shí)驗(yàn)表明，治療組對(duì)VD模型大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能有一定幫助。而在本實(shí)驗(yàn)中各組VD大鼠造模28 d完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，海馬區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，而治療組與VD模型組相比Bcl-2蛋白表達(dá)增加的幅度明顯大于Bax蛋白，即雖然Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)均升高，但Bcl-2蛋白增加地更為明顯，發(fā)揮了Bcl-2作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)高表達(dá)后抑制神經(jīng)元凋亡的作用。本研究提示，丹紅注射液通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)以及認(rèn)知能力。對(duì)臨床中延緩VD發(fā)展有著重要意義，同時(shí)對(duì)中藥治療慢性疾病以及新藥的開發(fā)都有著重要的指導(dǎo)意義。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4616.2016.03.007

(收稿日期：2016-05-05)

Effect of Danhong Injection on Rats Behavior with Vascular Dementia and Apoptosis of Neuronal Cells in Hippocampal CA1

WANG Zhouyi，ZHOU Gang，XIAO Zhanchi，et al

HuanggangCentralHospital，Huanggang438000，China

AbstractObjectiveTo study the effect of Danhong injection on rats behavior with vascular dementia and apoptosis of neuronal cells in the hippocampal CA1.MethodsSuccessful model of rats VD were randomly divided into a treatment group and a VD model group.The treatment group received Danhong injection，while the normal group，sham-operation group，and VD model group were injected with saline.28 days later after the treatment behavioral tests were performed among these rats，and then the expressions of Bcl-2 and bax were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the VD model group，the escape latent period was significantly shorter in the treatment group，and the crossing target quadrant time was prolonged (P<0.05).The expressions of Bcl-2 and Bax protein in the hippocampus of the VD model group and the treatment group were significantly higher than those in the sham-operation group and the normal group.Compared with the VD model group，the increase of Bcl-2 expression in the treatment group was significantly greater than the increase of Bax (P<0.05).ConclusionDanhong injection can improve the ability of learning and cognizance by regulating the expressions of Bcl-2 and Bax to inhibit apoptosis of neuronal cells.

Key wordsDanhong injection；vascular dementia；apoptosis

*湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2015CFB625)

△通信作者，Correspongding author，E-mail：38449259@qq.com