張?jiān)圃啤↑S玲玲　王　濱　洪　侃　萬(wàn)鶴鳴　陸守榮　丁新生

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院，江蘇　無(wú)錫　214000)

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阿托伐他汀對(duì)老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后細(xì)胞凋亡的影響

張?jiān)圃泣S玲玲王濱洪侃萬(wàn)鶴鳴陸守榮丁新生1

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214000)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對(duì)老齡大鼠永久局灶性胡須體覺(jué)皮層缺血后凋亡的影響及機(jī)制。方法45只老齡大鼠依隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、對(duì)照組(等量生理鹽水)、阿托伐他汀處理組(20 mg/kg)。對(duì)照組及阿托伐他汀組于顯微鏡下結(jié)扎大腦中動(dòng)脈數(shù)根分支構(gòu)建局灶胡須體覺(jué)皮層缺血模型并于造模后0、6、24、48 h分別以生理鹽水及阿托伐他汀灌胃。造模后72 h應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)腦組織形態(tài)學(xué)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組缺血區(qū)周圍細(xì)胞凋亡及壞死率；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)缺血區(qū)周圍Caspase-3 及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-1 的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，阿托伐他汀對(duì)老齡大鼠72 h后有抗凋亡作用，其機(jī)制可能與減少缺血區(qū)周圍Caspase-3表達(dá)有關(guān)。該劑量阿托伐他汀對(duì)缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論阿托伐他汀可能通過(guò)減少老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后72 h的Caspase-3表達(dá)起著較好的抗凋亡作用。

〔關(guān)鍵詞〕阿托伐他??；腦缺血；凋亡

流行病學(xué)調(diào)查顯示年齡超過(guò)55歲后，腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)每十年增加1倍，而且其神經(jīng)祖細(xì)胞及非成熟神經(jīng)元隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸增加。本研究探討阿托伐他汀對(duì)老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后72 h凋亡及壞死影響及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器雄性SD大鼠20～22 月齡45只。阿托伐他汀輝瑞制藥公司。AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司。Caspase-3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)-1抗體購(gòu)自Santa-Cruz公司。免疫組化試劑盒武漢博士德生物有限公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司。Leica 彩色圖像分析系統(tǒng)；GS-2010 手術(shù)顯微鏡(常州三能光學(xué)設(shè)備有限公司)；10-0帶線縫合針(上海醫(yī)菱醫(yī)療器械銷售公司)，多導(dǎo)生理記錄儀、TSD 激光多普勒探頭、激光多普勒血流儀(Biopac公司，美國(guó))。

1.2模型制備大鼠麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)顳部皮膚和肌肉，用手術(shù)電鉆開(kāi)6～8 mm的顱窗，刺激對(duì)側(cè)胡須，激光多普勒血流儀測(cè)定刺激前后局部腦血流，確定體覺(jué)皮層支配血管后在顯微鏡下以10-0 手術(shù)線穿過(guò)硬腦膜，結(jié)扎胡須體覺(jué)皮層周圍數(shù)根大腦中動(dòng)脈的分支，激光多普勒血流儀再次測(cè)定局部腦血流，同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)勁總動(dòng)脈10 min。假手術(shù)組的大鼠麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)顳部皮膚和肌肉，用手術(shù)電鉆開(kāi)6～8 mm顱窗，不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈樹(shù)根分支〔1〕。

1.3大鼠分組45只老齡大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組及阿托伐他汀組，對(duì)照組及阿托伐他汀組予術(shù)后0、6、24、48 h以20 mg/kg生理鹽水及阿托伐他汀灌胃，72 h后處死各組大鼠。

1.4病理學(xué)觀察假手術(shù)組、對(duì)照組及阿托伐他汀組進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅( HE) 染色,光鏡下觀察腦缺血72 h后組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺血區(qū)凋亡各組大鼠處死于75%酒精浸泡1～3 min放置超凈工作臺(tái)，取出大腦缺血區(qū)及周圍組織并將其置于事先消毒好的200目篩網(wǎng),輕輕研磨腦組織，使其變成單個(gè)細(xì)胞，待研碎后用培養(yǎng)液沖洗，細(xì)胞篩下容器內(nèi)所盛溶液為單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞重懸于500 μl上樣緩沖液,加入5 μlAnnexinV-FITC 和5 μl PI,混勻后室溫避光反應(yīng)10 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.6取材及切片制備72 h后各組分別取5只大鼠麻醉后打開(kāi)腹腔，剪開(kāi)肋骨，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈后快速依次灌注生理鹽水及4%多聚甲醛，斷頭取腦分離前囟前后1 mm腦組織浸入4%多聚甲醛固定6 h，蒸餾水漂洗，酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片5 張，片厚5 μm。

1.7免疫組化染色檢測(cè)缺血區(qū)周圍Caspase-3及VEGFR-1表達(dá)常規(guī)脫蠟至水，以Caspase-3、VEGFR-1抗體為一抗進(jìn)行操作，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，封片鏡檢。PBS 代替Caspase-3、VEGFR-1抗作陰性對(duì)照。采用Leica計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)組織切片圖像分析，以細(xì)胞呈棕色或棕褐色為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片計(jì)算5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)數(shù)，取其平均值來(lái)作為Caspase-3、VEGFR-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS16.0軟件,行單因素方差分析，方差齊時(shí)進(jìn)一步采用LSD進(jìn)行兩兩比較。

2結(jié)果

2.1HE染色假手術(shù)組腦組織細(xì)胞正常，老齡大鼠腦缺血后72 h神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞變性，胞核溶解，可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片。阿托伐他汀組老齡大鼠缺血后72 h神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞亦有水腫、變性壞死，但較模型組細(xì)胞稍完整(圖1)。

圖1　老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后72 h病理學(xué)觀察(HE，×200)

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺血區(qū)凋亡情況假手術(shù)組可見(jiàn)少量凋亡及壞死細(xì)胞，對(duì)照組及阿托伐他汀組的細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對(duì)照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)明顯減少(表1)。

2.3免疫組化染色檢測(cè)缺血區(qū)周圍Caspase-3表達(dá)假手術(shù)組僅可見(jiàn)少量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組及阿托伐他汀組的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對(duì)照組缺血72 h組相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h組的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖2，表1)。

表1　各組老年大鼠凋亡及壞死率及Caspase-3、VEGFR-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與對(duì)照組比較：2)P<0.01

圖2　免疫組化染色檢測(cè)老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后72 h的Caspase-3表達(dá)(DAB，×200)

2.4免疫組化染色檢測(cè)缺血區(qū)周圍VEGFR-1表達(dá)假手術(shù)組僅可見(jiàn)少量VEGFR-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組及阿托伐他汀組的VEGFR-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較相應(yīng)假手術(shù)組均明顯增加，與對(duì)照組缺血72 h相比，阿托伐他汀組老齡缺血72 h的VEGFR-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(圖3，表1)。

圖3　免疫組化染色檢測(cè)老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)(DAB，×200)

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對(duì)老齡大鼠晚期凋亡有明顯保護(hù)作用，其與減少Caspase-3表達(dá)可能有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該劑量的阿托伐他汀對(duì)缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無(wú)明顯影響。

腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡包括缺血中心早期凋亡和半暗帶區(qū)的遲發(fā)性凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在生理狀態(tài)下的死亡過(guò)程，其有促進(jìn)和凋亡基因共同作用。Caspase家族是目前哺乳動(dòng)物凋亡的主要啟動(dòng)因子，其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)瀑布下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶。正常情況下，Caspase-3參與細(xì)胞凋亡可以通過(guò)線粒體途徑和細(xì)胞表面受體途徑來(lái)發(fā)揮作用〔2〕。早期研究〔3〕表明在局灶性永久性腦缺血模型中,利用Northern印跡分析提示缺血側(cè)半球腦組織缺血后16～ 24 h,Caspase-3水平顯著增高。還有研究發(fā)現(xiàn)抑制Caspase-3的活化可以減輕以細(xì)胞凋亡為主要機(jī)制的缺血后遲發(fā)性細(xì)胞損害，增加存活神經(jīng)元數(shù)量，縮小腦梗死體積，并改善神經(jīng)功能〔4～6〕。

年齡對(duì)腦組織缺血后的凋亡及修復(fù)有著重要的影響，Davis 等〔7〕比較了成年和老齡大鼠腦組織梗死后梗死體積情況，提示老齡大鼠的梗死體積較成年大鼠體積增大，推測(cè)腦梗死的體積與增齡有關(guān)。李建生等〔8〕研究表明老齡大鼠腦缺血3 h和I/R12 h 腦梗死面積較青年大鼠增大，隨著I/R 時(shí)間延長(zhǎng),腦組織細(xì)胞損傷逐步加重,老齡大鼠較青年大鼠嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡隨著I/R 時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加,老齡大鼠出現(xiàn)的早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。本研究藥物對(duì)老齡大鼠胡須體覺(jué)皮層永久性腦缺血模型晚期凋亡及壞死率的保護(hù)作用更符合臨床中出現(xiàn)的病例特征。

研究發(fā)現(xiàn)腦組織軸突損傷后可以修復(fù)，但修復(fù)能力較弱，可能周圍微環(huán)境影響其修復(fù)過(guò)程〔9〕。腦缺血后神經(jīng)修復(fù)依賴于軸突的生長(zhǎng)、準(zhǔn)確的投射及突觸的形成〔10〕，其過(guò)程不僅僅需要營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子等調(diào)控，與軸突生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)有著密切的關(guān)系〔11〕。VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞的分裂原，主要與細(xì)胞表面受體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、加速新生血管形成〔12,13〕。VEGF同時(shí)能夠促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)起著直接營(yíng)養(yǎng)的作用〔14〕。VEGFR包括：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR-3(Flk-4)及神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白(NP)-1和NP-2。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面主要是VEGFR-1與VEGFR-2，VEGFR-2主要是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化，VEGFR-1也參與該過(guò)程。VEGFR-1的胞外部分則比VEGFR-2對(duì)VEGF具有更高的親和力，能以可溶形式存在〔15〕。VEGF主要通過(guò)VEGFR-1與VEGFR-2在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮作用〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)該劑量的阿托伐他汀對(duì)缺血后72 h的VEGFR-1表達(dá)無(wú)明顯影響，可能考慮與阿托伐他汀的劑量及作用時(shí)間有關(guān)。

他汀類藥物，即3-羥基3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一類強(qiáng)效降膽固醇藥物。既往研究表面阿托伐他汀鈣具有降低血脂、穩(wěn)定斑塊、預(yù)防卒中復(fù)發(fā)等作用〔17,18〕。阿托伐他汀可能通過(guò)上調(diào)eNOS挽救缺血周圍區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，而與血清膽固醇水平無(wú)關(guān)〔19～22〕。

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〔2014-12-08修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：無(wú)錫市科技計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(SCZ00N1102)；南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金面上項(xiàng)目(2011njmu023)

通訊作者：王濱(1960-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病及神經(jīng)變性病研究。

〔中圖分類號(hào)〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3128-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.015

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省人民醫(yī)院

第一作者：張?jiān)圃?(1985-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。