張鳳香　賀成業(yè)　李晨光　孫大鵬

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科,遼寧　錦州　121001)

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鈣敏感受體對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響

張鳳香賀成業(yè)李晨光孫大鵬

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科,遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的觀察鈣敏感受體(CaSR)對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)數(shù)量及功能的影響。方法培養(yǎng)并鑒定EPCs；RT-PCR和Western 印跡檢測(cè)EPCs中CaSR的表達(dá)情況；MTT法觀察CaSR對(duì)EPCs增殖能力的影響;Tube形成和遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CaSR對(duì)EPCs血管新生能力和遷移能力的影響；Western 印跡檢測(cè)CaSR對(duì)EPCs中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果RT-PCR和Western 印跡結(jié)果顯示在EPCs中有CaSR的表達(dá)；MTT法、Tube形成和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比較,CaSR激動(dòng)劑組EPCs增殖、遷移能力和血管形成能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而CaSR抑制劑組EPCs增殖、遷移能力和血管形成能力明顯降低 (P<0.05)；Western 印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比較,CaSR激動(dòng)劑組VEGF和CaSR表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CaSR抑制劑組VEGF和CaSR表達(dá)明顯降低。結(jié)論EPCs中有CaSR的表達(dá)，并且CaSR可以影響EPCs的數(shù)量、遷徙和血管形成能力。

〔關(guān)鍵詞〕鈣敏感受體;內(nèi)皮祖細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是引起人類心腦血管疾病的重要原因之一，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。目前研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和激活可以影響AS的發(fā)生，從而影響心腦血管系統(tǒng)的穩(wěn)定。因此，血管內(nèi)皮功能的恢復(fù)和局部微循環(huán)的形成是防治AS的重要手段〔2〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一種起源于骨髓的原始細(xì)胞，除骨髓外，臍帶血和成人外周血中均存在 EPCs。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)EPCs可以提高血管內(nèi)皮功能和促進(jìn)新生血管的形成，進(jìn)而恢復(fù)缺血組織的功能以達(dá)到預(yù)防AS形成的作用〔3〕。鈣敏感受體(CaSR)是G蛋白耦聯(lián)受體超家族中C家族的一員。CaSR廣泛存在于心腦血管系統(tǒng)中，并通過(guò)在巨噬細(xì)胞和平滑肌等細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)參與AS的形成過(guò)程〔4〕。但CaSR是否在EPCs中存在表達(dá)尚不得而知。本實(shí)驗(yàn)主要探討CaSR在EPCs中是否存在表達(dá)以及CaSR是否對(duì)EPCs的增殖、遷徙及血管形成產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響AS的形成。

1材料和方法

1.1材料CaSR激動(dòng)劑GdCl3、CaSR 抑制劑NPS2390(上海生工)；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破饭?；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)；胰 蛋 白 酶、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1，Cytolab公司)；人纖維連接蛋白(Haematologic Technologic公司)；兔抗人CaSR抗體、兔抗人VEGF抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗、兔抗β-actin 單克隆抗體 (北京中杉金橋公司)。

1.2EPCs的培養(yǎng)及分組取健康成人空腹外周血,通過(guò)密度梯度離心(Ficoll-Paque,1.077,Amersham Bioscience)收集獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞,將3×106/ml單個(gè)核細(xì)胞鋪在包被有人纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板。加入M199完全培養(yǎng)基0.5 ml,5% CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)3 d,用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d,然后用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、GdCl3組及NPS2390組。

1.3EPCs的鑒定貼壁細(xì)胞棄上清，37℃與含Dil-ac-LDL (2.4 mg/ml)的 M199培養(yǎng)液孵育1 h，PBS浸洗，用2%多聚甲醛固定10 min，再加入FITC-UEA-I (10 mg/ml)， 37℃孵育1 h，PBS 浸洗。激光共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I和Dil-ac-LDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為早期EPCs。

1.4EPCs增殖能力檢測(cè)將等量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、GdCl3組及NPS2390組，分別培養(yǎng)培養(yǎng)24、48、72 h。檢測(cè)時(shí)各組每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h，棄上清液，然后每孔加入150 μl DSMO，微量振蕩器上振蕩10 min，室溫孵育30 min后放入酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值。

1.5EPCs遷移能力檢測(cè)用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化收集貼壁細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸液,以5×104/孔的細(xì)胞數(shù)加入孔徑為0.8 μm的Transwell小室的上室,每孔體積100 μl。37℃培養(yǎng)48 h后取出濾膜，棉簽拭去上室濾膜外表面殘存細(xì)胞，對(duì)遷移至濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞用20 g/L多聚甲醛固定，PBS洗滌，蘇木素染色風(fēng)干后在吸收波長(zhǎng)530 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm處測(cè)熒光值，以百分率表示。

1.6EPCs血管形成能力檢測(cè)Matrigel膠4℃過(guò)夜后以1∶2 稀釋后平鋪在 24 孔板，置于 37℃培養(yǎng)箱 1 h。加入GdCl3或NPS2390，然后加入胰酶收集細(xì)胞，置于 37℃培養(yǎng)箱 48 h，Tube 的形成定義為形成管狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)為寬的 4倍，通過(guò)倒置顯微鏡(×100)隨機(jī)選擇 6 個(gè)視野觀察，用 Adobe Photoshop 分析每個(gè)視野總的 Tube 視野的管腔結(jié)構(gòu)數(shù)后取其均值。

1.7Western 印跡檢測(cè)CaSR和VEGF表達(dá)情況收集各組細(xì)胞以冷PBS洗2次，以裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測(cè)定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠6%，分離膠10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h。分別與1∶1 000兔抗人VEGF抗體和1∶600兔抗人CaSR抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500)，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

1.8RT-PCR檢測(cè)CaSR mRNA表達(dá)培養(yǎng)48 h后收集并計(jì)數(shù)各組細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)：CaR:正義鏈5′-TTCGGCATCAGCTTTGTG-3′ ；反義鏈5′-TGAAGATGATTTCGTCTTCC-3′；β-actin:正義鏈5′-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3′；反義鏈5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3′。擴(kuò)增條件:95℃ 15 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1EPCs的鑒定分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后呈梭形樣改變。Dil-acLDL和FITC-UEA-1對(duì)細(xì)胞染色后通過(guò)共聚焦顯微鏡鑒定,雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。見(jiàn)圖1。

2.2EPCs中CaSR的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組未加入CaSR抗體無(wú)任何條帶出現(xiàn),而CaSR抗體組則可見(jiàn)明顯條帶出現(xiàn), 研究提示CaSR在EPCs中存在表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.3CaSR對(duì)EPCs增殖能力的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：作用細(xì)胞24、48和72 h后，與正常對(duì)照組比較GdCl3組明顯促進(jìn)EPCs增殖，當(dāng)作用至48 h這種促進(jìn)作用達(dá)到高峰(P<0.05)；而NPS2390組與正常對(duì)照組比較明顯抑制EPCs增殖，當(dāng)作用至48 h這種抑制作用達(dá)到高峰(P<0.05)。見(jiàn)表1。

A:FITC-UEA-I標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光; B:DiI-acLDL標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光;C:雙重染色陽(yáng)性的細(xì)胞呈黃色熒光 圖1　共聚焦顯微鏡鑒定EPCs(×200)

1：陰性對(duì)照組 2：CaSR抗體組圖2　EPCs中鑒定CaSR的表達(dá)

2.4CaSR對(duì)EPCs遷移能力的影響作用細(xì)胞24、48和72 h后，與正常對(duì)照組比較GdCl3組明顯增強(qiáng)EPCs的遷移能力，當(dāng)作用至48 h這種增強(qiáng)作用達(dá)到高峰(P<0.05)；而NPS2390組與正常對(duì)照組比較明顯抑制EPCs的遷移能力，當(dāng)作用至48 h這種抑制作用達(dá)到高峰(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5CaSR對(duì)EPCs管腔形成能力的影響作用細(xì)胞24、48和72 h后，與正常對(duì)照組比較GdCl3組明顯增強(qiáng)EPCs的管腔形成能力，當(dāng)作用至48 h這種增強(qiáng)作用達(dá)到高峰(P<0.05)；而NPS2390組與正常對(duì)照組比較明顯抑制EPCs的管腔形成能力，當(dāng)作用至48 h這種抑制作用達(dá)到高峰(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1　CaSR對(duì)EPCs體外增殖能力的影響

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05,下表同

表2　CaSR對(duì)EPCs遷移能力的影響

表3　CaSR對(duì)EPCs管腔形成能力的影響

2.6CaSR對(duì)EPCs內(nèi)VEGF和CaSR蛋白表達(dá)的影響作用48 h后，Western 印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比,GdCl3組VEGF和CaSR蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),而NPS2390組VEGF和CaSR蛋白表達(dá)明顯減弱。見(jiàn)圖3。

1:正常對(duì)照組；2:NPS2390組；3:GdCl3組 圖3　Western 印跡鑒定VEGF和CaSR蛋白的表達(dá)

3討論

AS是造成人體心、腦血管疾病的主要原因之一，對(duì)AS發(fā)病機(jī)制和防治方法的研究正成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，血管內(nèi)皮細(xì)胞在AS的形成過(guò)程中起到十分重要的作用，是 AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。EPCs是一種可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,它可以參與血管內(nèi)皮損傷后的再生與修復(fù)，從而影響AS的形成〔5，6〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),在很多組織細(xì)胞中均有CaSR的表達(dá)，如心肌組織、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞〔7～9〕。但CaSR是否在EPCs中存在表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CaSR在EPCs中存在表達(dá)，增強(qiáng)CaSR的表達(dá)能夠明顯增加EPCs的數(shù)量、促進(jìn)外周血EPCs的遷移；而抑制CaSR的表達(dá)能夠明顯降低EPCs的數(shù)量、減少外周血EPCs的遷移。VEGF是血管生成的關(guān)鍵因子之一。VEGF不但可以促進(jìn)EPCs的遷移和新血管的生長(zhǎng)和形成，還可以通過(guò)提高EPCs分裂和增生能力，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)〔10～12〕。本研究結(jié)果說(shuō)明CaSR能夠?qū)PCs血管的生成產(chǎn)生影響，這種影響可能與 VEGF的表達(dá)變化有關(guān)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。綜上所述，EPCs中有CaSR的表達(dá)，并且CaSR可以影響EPCs的數(shù)量、遷徙和血管形成能力，這種促進(jìn)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81541099)；遼寧省自然科學(xué)基金(2013022010)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目 (XZJJ 20130246)

通訊作者：孫大鵬(1978-)，男，副教授，博士后，主要從事生物治療研究。

〔中圖分類號(hào)〕R39

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3098-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.004

Effect of calcium-sensing receptor on the number and function of endothelial progenitor cells

ZHANG Feng-Xiang,HE Cheng-Ye,LI Chen-Guang,et al.

Department of Cardiac Surgery,the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of calcium-sensing receptor (CaSR) on the number and function of endothelial progenitor cells (EPCs).MethodsThe EPCs were cultured and identified.Realtime-PCR and Western blot were used to detect the expression of CaSR in EPCs.MTT was used to detect the effect of CaSR on the proliferation of EPCs.Tube formation and migration test were used to measure the effect of CaSR on the angiogenesis and migration of EPCs.Western blot was used to detect the expression of vessel endothelial growth factor (VEGF).ResultsRT-PCR and Western blot analysis showed there was CaSR expression in EPCs.MTT method ,Tube formation and migration assay showed,compared with normal control group,EPCs proliferation,migration and angiogenesis were markedly enhanced in CaSR agonist group (P<0.05),while EPCs proliferation,migration and angiogenesis were markedly reduced in CaSR inhibitor group (P<0.05).Western blot showed that,compared with the control group ,VEGF and CaSR expression were significantly increased in CaSR agonist group,while were significantly reduced in CaSR inhibitor group (P<0.05).ConclusionsCaSR could express in EPCs，CaSR not only could affect the number of EPCs but also the migration and angiogenesis capabilities of EPCs.

【Key words】Calcium-sensing receptor; Endothelial progenitor cells; Vascular endothelial growth factor

第一作者：張鳳香(1978-),女，博士,副教授，副主任醫(yī)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。