徐太哲，李　麗，王長山

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

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小鼠外周血單個核細胞分離、純化①

徐太哲1，李麗2，王長山2

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要:目的:探討小鼠外周血單個核細胞(PBMC)最佳分離條件，提高細胞獲得率與純度，以便后續(xù)分子生物學(xué)實驗。方法:小鼠摘除眼球取血，設(shè)置離心力、離心時間、實驗環(huán)境溫度等梯度優(yōu)化，分別采用EDTA-K2、肝素、枸櫞酸鈉 抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個核細胞，直接進行貼壁培養(yǎng)和分析獲得率、純度，計數(shù)存活率。結(jié)果:Ficoll密度梯度離心法經(jīng)條件優(yōu)化后分離的PBMC純度可達85%，細胞獲得率最高可達80%以上，活細胞百分率在92%以上。結(jié)論:Ficoll密度梯度離心法在優(yōu)化條件下可有效地分離PBMC，對后續(xù)分子生物學(xué)實驗無影響。

關(guān)鍵詞：小鼠;Ficoll密度梯度離心;PBMC

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴細胞和單核細胞。是免疫系統(tǒng)的重要組成，是研究免疫老化和衰老的主要依據(jù)。研究T、B淋巴細胞首要分離外周血單個核細胞，主要的分離方法是Ficoll-hypaque密度梯度離心法，因血液中各組成成分的沉降系數(shù)存在差異，而得以分離[1]。離心后，單個核細胞因與分離液密度相當，集中在血漿層和分層液的界面上，呈白霧層，吸取該層細胞經(jīng)洗滌離心即獲得PBMC。PBMC分離是分子生物學(xué)試驗常用的技術(shù)，其效果直接影響PCR等后續(xù)試驗結(jié)果。實驗對象小鼠因體重小，體內(nèi)血液量少，F(xiàn)icoll密度梯度離心法正適用這樣少量血液的分離，本文探討小鼠外周血單個核細胞的分離最佳條件。

1材料和方法

1.1材料與分組

BALB/c小鼠18只，5～6月齡，體重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血單核細胞分離液試劑(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1取血與離心

摘除眼球取血：抓取小鼠，側(cè)臥位，食指按壓眼部皮膚致眼球突出。眼科彎鑷迅速摘除眼球，倒立鼠，接取滴流血液。采血完畢紗布壓迫止血[2]。每次采血量0.7～1mL。按乙二胺四乙酸鹽(EDTA-K2)抗凝、肝素抗凝、枸櫞酸鈉抗凝，將抗凝血標本分為3個實驗組，每組6例，相互對照[3]。

Ficoll密度梯度離心：首先取抗凝血與RPMI1640培養(yǎng)液等體積混勻，再加相當于抗凝血2倍體積的淋巴細胞分離液，于400～600×g離心20～30min，謹慎吸取單核細胞層，RPMI1640培養(yǎng)液洗兩遍備用[4～7]。

因細胞獲得率與純度關(guān)系到實驗效果，一般根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，其離心時間越長，最終目的是達到最佳分離效果，對于小鼠本實驗依據(jù)離心力、離心時間等設(shè)置優(yōu)化梯度，因細胞獲得率的高低與室溫還有關(guān)，室溫設(shè)置3個優(yōu)化梯度[8]。

1.2.2PBMC的差異貼壁法純化

將獲取的PBMC計數(shù)后，用單核細胞完全培養(yǎng)基以4×106個/mL的密度重懸細胞，將細胞鋪于24孔培養(yǎng)板，每孔2×106細胞，放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。2～4h內(nèi)貼壁的為巨噬細胞前體(俗稱為單核細胞)，吸去培養(yǎng)液上清，用RPMI1640培養(yǎng)液輕輕洗滌培養(yǎng)孔3次，去除非貼壁細胞。收集貼壁細胞即獲得貼壁法純化的PBMC。

1.2.3PBMCs純度

收集貼壁細胞，用含有10%小牛血清的RPMI1640重懸后，涂片進行瑞氏(美藍-伊紅Y)染料，計數(shù)100個細胞，計算單個核細胞純度，單個核細胞純度=(淋巴細胞數(shù)+單核細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4計數(shù)PBMCs

洗滌1.2.2獲得的PBMCs 2次，即加適量PBS或RPMI1640培養(yǎng)液、混勻、600g離心5min棄上清，重復(fù)2次。加PBS懸浮細胞，臺盼藍染液染色，死的細胞可被染成藍色，活細胞不著色。倒置顯微鏡10× 物鏡下計數(shù)200個PBMCs活細胞百分率和細胞總數(shù)(存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1抗凝劑分離的PBMC細胞獲得率、純度、存活率

PBMC獲得率：EDTA-K2組與肝素組比較差異顯著(P<0.05)，EDTA-K2組獲得率較高，而枸櫞酸鈉組與肝素組獲得率比較，差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBMC純度：EDTA-K2組與肝素組比較差異顯著(P<0.05)，肝素組PBMC純度較高，而枸櫞酸鈉組與EDTA-K2組比較，純度則差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PBMC存活率：EDTA-K2組、肝素組和枸櫞酸鈉組比較，細胞存活率差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　不同抗凝劑分離PBMC獲得率、純度、存活率

注：*P<0.05。

2.2不同離心力、離心時間的PBMC細胞獲得率

在相同離心時間不同的離心力下，500g離心力下效果好于400g和600g；在相同離心力下時間越長收集的PBMCs細胞獲得率越高，但不同時間下差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2不同離心力、離心時間的PBMC獲得率

離心力時間20min25min30min400×g70.67±1.4672.05±1.4872.13±1.61500×g87.31±1.9589.90±1.3890.65±1.79600×g77.46±2.2180.78±1.9376.78±1.28

2.3不同環(huán)境溫度下PBMC獲得率

比較20℃、25℃和30℃三個環(huán)境溫度下PBMC獲得率，如表3可知，環(huán)境溫度20℃時PBMC獲得率最高，25℃次之和30℃最低，環(huán)境溫度30℃PBMC獲得率較20℃差異顯著(P<0.05)。20℃與25℃下差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　不同環(huán)境溫度下PBMC獲得率

注：*P<0.05。

3討論

分離PBMC是一項實驗和臨床時常要做的工作,比如外周血單個核細胞培養(yǎng)的上清液中細胞因子等對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床疾病有一定實用價值[9～14]。傳統(tǒng)方法采用Ficoll-hypaque密度梯度離心，小鼠外周血單核細胞分離液比重為1.080，因血液中各組成成分的沉降系數(shù)存在差異Ficoll在一定離心力的作用下離心時，血液中各組成成分將按密度的梯度重新聚集[15]。密度較低的血小板和血漿懸于分層液上部；密度較大的紅細胞與粒細胞沉于分層液下部；由于PBMC密度稍低于分層液，則位于分層液界面上，小心吸取該層即可獲得PBMC。該法操作需將抗凝血作適當稀釋，比較適用于小鼠等血液量少的分離。特別說明，單核細胞分離液，在分離人PBMC時，其比重為1.077；而分離小鼠單個核細胞時比重為1.080。用本法分離PBMC，經(jīng)條件優(yōu)化后純度可達85%，細胞獲得率最高可達80%以上，活細胞百分率在92%以上。

PBMC的差異貼壁法純化時，收集2～4h內(nèi)貼壁貼壁細胞為巨噬細胞前體(俗稱為單核細胞)，而10～24h內(nèi)貼壁的細胞為內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、干細胞，不貼壁的則為淋巴細胞[16]?？傊珽DTA-K2組PBMC獲得率較肝素組高，而肝素組PBMCs純度較高，PBMC存活率三組細胞存活率差異不顯著。另外據(jù)報道，枸櫞酸鈉對細胞損傷小些。環(huán)境溫度在30℃PBMC獲得率較20℃差異顯著，超過25℃時會影響細胞獲得率。綜上所述，再考慮到細胞純度、細胞回收率、細胞存活率以及操作的難易等因素，我們認為Ficoll密度梯度離心法在優(yōu)化條件下可有效地分離PBMC，對后續(xù)分子生物學(xué)實驗無影響。

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基金項目：①1.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃，編號：1253G057;2.佳木斯大學(xué)自然科學(xué)基礎(chǔ)研究類重點項目，編號：Sjz2012-11。

作者簡介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治醫(yī)師。 通訊作者：王長山(1977～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wcs0451@163.com。

中圖分類號：R446.11+3

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0010-02

(收稿日期：2016-03-10)