汪寶林，金　松 ，范東旭 ，馮東凡， 謝　涵

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)及Notch信號(hào)通路對(duì)其細(xì)胞增殖及凋亡的研究①

汪寶林，金松 ，范東旭 ，馮東凡， 謝涵

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)后采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)并探討DM大鼠VSMCs細(xì)胞增值及凋亡機(jī)制。方法：應(yīng)用腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素的方法對(duì)大鼠進(jìn)行糖尿病造模。造模后別于CON組和DM組(1、2、3、4)各組中隨機(jī)取出1只SD大鼠，取出主動(dòng)脈并制備成細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行傳代，應(yīng)用不同梯度濃度γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對(duì)Notch信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DM大鼠VSMCs細(xì)胞增值及凋亡情況。結(jié)果：不同梯度濃度的DAPT作用DM大鼠VSMCs72h后行流式細(xì)胞儀分析，G0/G1期細(xì)胞比例由39.97%上升為72.32%，S 期的細(xì)胞比例從41.10%下降為19.87%，凋亡數(shù)卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。結(jié)論：DAPT能影響DM大鼠VSMCs的細(xì)胞周期，減少DM大鼠VSMCs的有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖反向增加細(xì)胞凋亡數(shù)，這二者作用均具有依賴(lài)性且呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)通路；血管平滑肌細(xì)胞；體外培養(yǎng)；流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目前，對(duì)于糖尿病足的治療大多處于內(nèi)科治療聯(lián)合局部清創(chuàng)治療為主，截趾、截跖、截肢是最終結(jié)果[1]。介入治療和血管重建需要的設(shè)備精密價(jià)格昂貴，手術(shù)費(fèi)用高，并發(fā)癥多，術(shù)后再狹窄率高[2]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究表明，Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等[3]。本課題研究DM大鼠主動(dòng)脈VSMCs體外培養(yǎng)及Notch信號(hào)通路受干預(yù)后對(duì)其影響的情況，以及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為進(jìn)一步研究DM缺血區(qū)血管新生提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

SPF(Specific Pathogen Free，無(wú)特定病原體)級(jí)SD大鼠雄性3只、雌性6只，2月齡，體重：雄性：(191±2.5)g，雌性：(207±1.9)g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量合格證0003546。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1大鼠造模

糖尿病大鼠模型建立：雄性SD大鼠幼鼠50只，隨機(jī)抽取10只為正常對(duì)照組(CON組)，其余40只為糖尿病組(DM組)。CON組一次性腹腔注射0.1mL/100g無(wú)菌檸檬酸緩沖液(0.1mmol/L, pH4.4)；DM組按45mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)。每日觀(guān)察幼鼠情況并給予脂肪乳高糖混合液喂養(yǎng)。分別于造模后7d、14d、21d檢測(cè)各幼鼠血糖變化情況，3次測(cè)量血糖值均≥16.7mmol/L列為糖尿病模型。

2.2糖尿病SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)[4]

①8周齡時(shí)，分別于CON組和DM組各組中隨機(jī)取出一只SD大鼠，鈍性分離暴露心臟至主動(dòng)脈段血管，取出主動(dòng)脈，迅速移至無(wú)菌D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中。②在體式解剖顯微鏡下，剝脫血管外膜，縱向剪開(kāi)血管壁，刮除內(nèi)膜后剩余血管中膜，除去殘留中膜外組織雜質(zhì)。③放入胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中并將其剪碎，離心5min，棄上清，取沉淀，往沉淀物中加入0.5% EDTA ·4Na消化30 s。④加入等體積DMEM 培養(yǎng)基終止消化并1500 r/min(r=13.5cm)離心5min，棄上清液，離心管中加入2 mL 新鮮培養(yǎng)基重懸。⑤用吸管將其移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼附于底面，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～3 h后，組織塊貼壁后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，加入適量含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，使組織塊完全浸沒(méi)于培養(yǎng)液之中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。⑥培養(yǎng)至8～12d時(shí)倒置相差顯微鏡下觀(guān)察見(jiàn)80%細(xì)胞已融合，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代及檢測(cè)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

2.3.1細(xì)胞周期及增值測(cè)定

①取對(duì)數(shù)期的DM大鼠VSMCs，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，以2.0×105/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。②加入工作液濃度為0.15、1.25、2.50、7.50、10.00μmol/Lγ-分泌酶抑制劑DAPT，Control組不加，繼續(xù)培養(yǎng)72h。③收集所有細(xì)胞，簡(jiǎn)單細(xì)胞計(jì)數(shù)，將約1×106個(gè)細(xì)胞移入離心管中，1000r/min(r=13.5cm)離心5min，棄去上清后。用PBS溶液清洗×1次，在離心管中留約0.5mL PBS，加70%冰乙醇5mL混勻固定，4℃放置48h以上，離心棄上清。PBS清洗×1次，在離心管中留1mL PBS，輕輕吹打均勻細(xì)胞，加入10mg/mL的RNAse5μL，37℃放置1h。加入100μg/mL的PI工作液10μL，室溫避光染色30min，計(jì)數(shù)20000～30000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相。細(xì)胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細(xì)胞增殖的兩個(gè)重要指標(biāo),兩者之合稱(chēng)為增殖指數(shù),而增殖指數(shù)的大小則反映細(xì)胞增殖水平的高低。

2.3.2細(xì)胞凋亡測(cè)定

步驟與周期測(cè)定一致，在乙醇固定后上機(jī)檢測(cè)：①上機(jī)檢測(cè)前離心去除乙醇。②冷I,Bs(pH7.4)洗5min后離心,重復(fù)2次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106個(gè)/L。③加入pl工作液0.5mL,終濃度為10m叭,室溫避光30min后上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。以P<0.05有顯著性差異。

3結(jié)果

3.1細(xì)胞周期結(jié)果

各組72h后行流式細(xì)胞儀分析，G0/G1期細(xì)胞比例由Control組的39.97%上升為72.32%，S期的細(xì)胞比例從Control組的41.10%下降為19.87%見(jiàn)表1，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　各組細(xì)胞周期結(jié)果(%)

3.2細(xì)胞增殖與凋亡

細(xì)胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細(xì)胞增殖的兩個(gè)重要指標(biāo),兩者之合稱(chēng)為增殖指數(shù),而增殖指數(shù)的大小則反映細(xì)胞增殖水平的高低。各組經(jīng)不同濃度γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后，其增值與凋亡見(jiàn)表2。Control組的細(xì)胞增殖指數(shù)從35.65降到15.42(P<0.05)，凋亡數(shù)卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。

表2　各組細(xì)胞增值與凋亡結(jié)果

4討論

糖尿病足的發(fā)病率國(guó)外報(bào)道為5.3%～10.5%，我國(guó)國(guó)內(nèi)報(bào)道是8.57%，2-DM患者的截肢率比非DM患者高17～40倍[5]，且正逐年增加，不但嚴(yán)重威脅DM患者的健康和生活質(zhì)量，而且也造成了巨大的醫(yī)療、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。近年來(lái)已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)生對(duì)DF的關(guān)注與重視，并積極研究其治療方法。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究表明，Notch信號(hào)通路能促進(jìn)非糖尿病動(dòng)物缺血區(qū)的血管新生、動(dòng)靜脈分化等[3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)DM大鼠模型凍存細(xì)胞復(fù)蘇開(kāi)始，采用不同梯度濃度的DAPT進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DM大鼠VSMCs細(xì)胞周期情況并計(jì)算出其增殖指數(shù)及細(xì)胞凋亡數(shù)分析探討Notch信號(hào)途徑對(duì)體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的影響，為進(jìn)一步研究糖尿病患者缺血區(qū)血管增值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為糖尿病足及糖尿病血管病變的治療提供新的思路。

γ-分泌酶在Notch信號(hào)通路激活的連鎖反應(yīng)中其重要作用，γ-分泌酶抑制劑(DAPT)可有效阻斷Notch信號(hào)通路中NICD的產(chǎn)生。 DAPT是人工合成的Notch信號(hào)通路抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進(jìn)而抑制Notch受體的在S3位點(diǎn)的酶切，而有效的抑制Notch信號(hào)通路的激活，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[6，7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同梯度濃度的DAPT作用DM大鼠VSMCs72h后行流式細(xì)胞儀分析，G0/G1期細(xì)胞比例由Control組的39.97%上升為72.32%，S 期的細(xì)胞比例從Control組的41.10%下降為19.87%，結(jié)果證明與Control組相比DAPT明顯抑制DM大鼠VSMCs進(jìn)入S期和G2/M期，且有濃度依賴(lài)性，，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細(xì)胞增殖的兩個(gè)重要指標(biāo),兩者之合稱(chēng)為增殖指數(shù),而增殖指數(shù)的大小則反映細(xì)胞增殖水平的高低[8]。各組經(jīng)不同濃度γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后，Control組的細(xì)胞增殖指數(shù)從35.65降到15.42(P<0.05)，凋亡數(shù)卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。證明DAPT能影響DM大鼠VSMCs的細(xì)胞周期，減少DM大鼠VSMCs的有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖，反向增加細(xì)胞凋亡數(shù)，這二者作用均具有依賴(lài)性且呈正相關(guān)。這闡明了Notch信號(hào)通路潛在的藥物治療靶點(diǎn)，可能成為DF、DM血管病變及缺血性疾病的治療提供新的手段和新方向。

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作者簡(jiǎn)介：①汪寶林(1988～)男，黑龍江大興安嶺人，碩士，醫(yī)師。 通訊作者：范東旭(1971～)男,黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: 809824056@qq.com。

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0105-02

(收稿日期：2015-05-04)