陳文學，鄒學森，黃秀珍，陳蕓

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西　南昌330029；2、江西省精神病院檢驗科，江西　南昌330029)

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·實驗研究·

兩種用于人乳頭瘤病毒檢測方法的比較分析

陳文學1，鄒學森1，黃秀珍1，陳蕓2

(1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西南昌330029；2、江西省精神病院檢驗科，江西南昌330029)

摘要：目的通過對核酸快速導流雜交基因芯片技術與熒光PCR技術檢測人乳頭瘤病毒的結果進行比較，為臨床人乳頭瘤病毒的診斷提供恰當的檢測方法。方法采用人乳頭瘤病毒分型基因芯片檢測系統(tǒng)和熒光PCR技術對78例子宮頸癌患者的宮頸脫落細胞進行人乳頭瘤病毒檢測。結果基因芯片分型檢測總陽性率為91.03%(71/78)，且均為高危型。單一感染52例，其中HPV16型陽性率為61.54%，HPV18陽性率為11.54%，其他類型感染陽性率26.92%。熒光PCR法檢測總陽性率為93.59%(73/78)，其中HPV16陽性檢出率45.21%，HPV18陽性檢出率9.59%。兩種檢測方法的符合率為97.4%。結論HPV導流雜交基因芯片技術和熒光PCR技術兩者具有良好的符合性，兩者都適用于臨床檢測，熒光PCR技術更適用與宮頸癌的大范圍篩查。

關鍵詞：人乳頭瘤病毒；基因芯片法；熒光PCR技術

人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導致宮頸癌發(fā)生的主要原因，且不同的HPV亞型的致病能力也不同，高危型HPV的持續(xù)感染是促進宮頸癌發(fā)生的主要因素[1，2]大部分HPV感染無臨床癥狀，不能通過常規(guī)的體檢發(fā)現，只有通過專門針對HPV的檢測才能發(fā)現。HPV的檢測方法主要有細胞學方法和分子生物學檢測。HPV分子生物學檢測方法包括雜交捕獲法、熒光PCR方法、原位雜交、斑點印記法等[3-6]。本研究通過對比其中兩種主要的方法導流雜交技術及熒光PCR技術檢測人乳頭瘤病毒，評價其在宮頸癌患者感染篩查中的應用。

1　資料與方法

1.1研究對象2015年1月至4月江西省腫瘤醫(yī)院初診宮頸癌患者72例，年齡32~68歲，所有患者均經病理證實為宮頸癌，并且無急性生殖道炎癥，標本采集前3d未使用陰道內藥物或陰道沖洗，標本采集在非月經期進行。

1.2研究方法

1.2.1導流雜交基因芯片技術試劑使用潮州凱普公司的HPV基因微陣列分型檢測試劑盒，儀器使用HybriMaxTM醫(yī)用核酸分子快速雜交儀。潮州凱普HPV基因微陣列分型檢測試劑盒可檢測出15中高危型HPV病毒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68），6種低危型HPV病毒[HPV6、11、42、43、44，CP8304（81）]。

1.2.2熒光PCR方法采用潮州凱普生物有限公司生產HR-HPV核酸檢測試劑盒檢測高危型HPV，同時對HPV16和HPV18進行分型檢測，可在同一反應管中通過儀器的4種熒光檢測通道分別檢測：⑴不分型12種HR-HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)；⑵HPV16；⑶HPV18；⑷細胞內β-globin基因。

1.2.3統(tǒng)計方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。

2　結果

基因芯片法可以檢測21種HPV亞型，包括中國人常見的感染15種高危型、6種低危型HPV感染，熒光定量PCR檢測方法可以檢測HPV16、HPV18和其他12種高危混合型HPV感染。本研究針對兩種方法對高危型HPV檢測進行比較。

2.1HPV基因芯片法檢測結果78例宮頸癌標本中HPV感染71例，感染率為91.03%，且均為高危型感染，其中單一感染52例，HPV16型感染32例，陽性率為61.54%，HPV18型感染6例，陽性率為11.54%，其他類型感染14例，占26.92%。多重感染16例，含有HPV16、HPV18、或HPV16/ HPV18雙重感染的標本15例。單一HPV亞型感染分布見表1。

表1　52例宮頸癌標本單一感染亞型分布表（基因芯片法）

2.2熒光PCR法檢測結果78例宮頸癌標本中檢測出73例高危型陽性，陽性率為93.59%，其中HPV16單通道陽性33例，陽性檢出率45.21%，其中HPV18單通道陽性7例，陽性檢出率9.59%，其他類型HPV感染單通道陽性的標本15例，兩通道陽性16例，其中HPV16/HPV18雙通道陽性2例，HPV16/Others雙通道陽性13例，HPV18/Others雙通道陽性1例，三通道感染HPV16/HPV18/Others陽性2例。各亞型分布見表2。

2.3兩種檢測方法的比較在78例標本中，基因芯片法高危陽性率為91.03%（71/78），熒光PCR法高危陽性率為93.59%(73/78)，兩種方法的高危型陽性率沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05），兩種方法有76例結果一致，總符合率為97.4%，其中1例基因芯片法檢測的高危陽性，熒光PCR法未檢出，1例基因芯片法檢測陰性，熒光PCR法檢測陽性。

表2　73例宮頸癌標本HPV感染亞型分布表（熒光PCR法）

3　討論

HPV是導致宮頸癌發(fā)生的主要因素，高危型HPV在宮頸癌患者中的感染率為88.4%~99.7%[7，8]。HPV不能進行體外培養(yǎng)，血清學檢測準確性較差，因此目前主要的檢測手段是形態(tài)學方法和分子生物學方法。形態(tài)學方法主要以挖空細胞為主要診斷依據，因此特異性和敏感性較差，分子生物學技術中PCR方法是目前檢測敏感性和特異性均較高的方法。本研究重點基因芯片法和熒光PCR技術均是以PCR方法為基礎的。

基因芯片法是通過將分子探針固定于支持物上，與PCR產物或標本分子的核酸進行雜交，通過檢測雜交探針的信號從而獲得標本的信息?；蛐酒蓹z測同一標本中的多種HPV感染亞型，同時可判斷多重感染[9-12]。

熒光PCR技術是設計出特異性引物及熒光標記探針，利用PCR技術擴增特定的靶區(qū)域，探針與引物同時結合于模板鏈上，熒光信號隨PCR產物增多而增強，通過熒光信號的強弱判斷PCR產物多少。

本研究通過對比基因芯片法和熒光PCR法檢測宮頸癌患者HPV的陽性率發(fā)現兩種方法檢測標本符合率很高，達到97.4%，HPV高危型感染率相近，無統(tǒng)計學差異。這與蔣衛(wèi)[13]報道的結果基因芯片法與熒光定量法檢測的符合率97.5%~100%一致。也有研究報道[14]基因芯片法的HPV檢出率（90%）明顯高于熒光定量PCR方法（36.57%）。胡麗杰報道[15]基因芯片分型檢測法陽性率為78.79%，明顯高于熒光定量PCR法(40，91%)和免疫組化法（38.89%）。對于文獻報道的HPV檢出率有較大差異，尤其是熒光定量PCR方法HPV的檢出率40.91%~93.59%，分析可能的原因⑴HPV檢測商品試劑盒的質量參差不齊，導致檢測結果出現較大差異。⑵不同的檢測方法有不同的靈敏度，PCR方法的靈敏度高于免疫組化法。⑶所采用的標本類型不同脫落細胞和腫瘤組織的檢出率也不同。

本研究還發(fā)現1例基因芯片法的檢測結果陰性，熒光PCR法檢測陽性，1例熒光PCR法檢測陰性而基因芯片法檢測陽性。分析可能的原因：基因芯片法檢測的HPV的L區(qū)，熒光PCR法檢測HPV的E區(qū)，基因芯片法檢測陰性的這個病例可能是HPV的L區(qū)丟失，而E區(qū)能夠檢測出。文獻報道宮頸癌HPV感染的患者中存在一部分L區(qū)丟失的現象，導致L區(qū)丟失的原因目前還不明確。因此基因芯片法和熒光PCR法各有優(yōu)點，基因芯片法能夠對HPV進行具體分型，有利于后期的隨訪，但是存在檢測的目的基因L區(qū)丟失導致的假陰性，熒光PCR方法檢測通量大，方便大規(guī)模的體檢，但是對HPV不能具體分型不利于隨訪觀察。兩種方法結合用于臨床檢測可以有效地彌補兩種檢測方法的不足。

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中圖分類號：R446.62，R737.33，R730.2

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)03-0291-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.011

基金項目：江西省衛(wèi)生計生委課題，編號：20155471

作者簡介：陳文學，女，1975年2月出生，博士學位，副主任技師、專業(yè)：腫瘤分子生物學、研究方向：腫瘤診斷。

(收稿日期2015-07-30；修回日期2016-04-14)

Comparison and analysis of two test methods of human papilloma virus

CHEN Wen1，ZOU Xuesen1，HUANG Xiuzhen1，CHEN Yun2. 1.Clinical Laboratory，Jiangxi Provincial Cancer Hospita，Nanchang 330029，China；2.Clinical Laboratory，Jiangxi Mental Health Centre，Nanchang 330029，China.

Abstract：Objective To find a better method for HPV test through the comparison of the human papilloma virus (HPV) test results using HPV genotyping chip system and fluoresence PCR method，respectively. Methods HPV were tested in 78 cervical exfoliative cell specimens of cervical cancers using HPV genotyping chip system and fluorensence PCR，respectively. The positive rate of HPV detected by HPV genotyping chip system is 91.03%(71/78)，and all of HPV detected were types of high risk. Among 52 case of single HPV infection，HPV16 positive rate was 61.54%；HPV18 positive rate is 11.54%；other type HPV positive rate is 26.92%. The HPV positive rate detected by fluorescence PCR is 93.59%(73/78)，among which HPV16 positive rate is 45.21% and HPV18 positive rate was 9.59%. The coincident rate of two test methods was 97.4%. Conclusion Two test methods exhibited good conformance，and were capable of clinically HPV testing. Fluorescene PCR methods were appropriate for large-scale cervical cancer screening.

Key words:Human papilloma virus；Genotyping chip technique；Fluoresence PCR technique