崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇　鹽城224001)

?

·綜述·

膽紅素對(duì)HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果的影響

崔蕾蕾，邵可可，左月媛

(鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城224001)

摘要：目的探討高膽紅素血清對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的影響，并選擇有效減低膽紅素對(duì)HBV DNA測(cè)定干擾的方法。方法將不同濃度的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3. 0×104IU/ml）按相同比例分別添加到膽紅素正常血清和高膽紅素血清中，按不同濃度膽紅素進(jìn)行分組來(lái)考察不同濃度膽紅素血癥對(duì)HBV DNA測(cè)定結(jié)果的影響程度大小，然后再分別測(cè)定HBV DNA的結(jié)果，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)三次，同時(shí)觀察擴(kuò)增曲線是否存在差異。對(duì)影響測(cè)定的血清標(biāo)本作10、100、1000倍稀釋后，進(jìn)行檢測(cè)，并收集5例臨床高膽紅素的乙肝血清標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果血清膽紅素濃度介于401~500μmol/L、501~600μmol/L、>600μmol/L三個(gè)組，HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果高于膽紅素正常血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），血清膽紅素濃度濃度介于20.6~100μmol/L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol/L四個(gè)組，與膽紅素正常血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；血清膽紅素濃度高于400μmol/L血清擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增曲線先緩慢升高，其基線高于標(biāo)準(zhǔn)品，其閾值線處于拐點(diǎn)之下非S擴(kuò)增區(qū)，之后升高呈現(xiàn)S型曲線；10、100、1000倍稀釋后，擴(kuò)增曲線平行且等間距，結(jié)果一致性較好。5例高膽紅素血清有4例在定閾值線時(shí)，其閾值線處于拐點(diǎn)之下非S擴(kuò)增區(qū)，定值偏高，結(jié)果高于稀釋后的標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；有1例閾值線處于拐點(diǎn)處，其斜率低于標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果低于稀釋后的標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論總膽紅素高于400μmol/L對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA結(jié)果存在影響，通過稀釋一般就可以降低膽紅素因素干擾。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；HBV DNA；膽紅素

我國(guó)目前有慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者9400萬(wàn)，其中慢性乙型肝炎患者2000萬(wàn)～4000萬(wàn)[1]。血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）水平是目前臨床上評(píng)價(jià)HBV復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且對(duì)非活動(dòng)性HBsAg攜帶狀態(tài)的判定有重要意義。目前HBV DNA的測(cè)定方法大多采用基于Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)，該方法具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，操作簡(jiǎn)單，定量范圍寬，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。影響PCR測(cè)定重復(fù)性和準(zhǔn)確性的因素，除了PCR本身因素外，標(biāo)本狀態(tài)直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[5-7]，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為黃疸對(duì)HBV DNA定量檢測(cè)無(wú)明顯影響[8，9]，而本人在日常工作中發(fā)現(xiàn)膽紅素濃度過高會(huì)導(dǎo)致血清HBV DNA測(cè)定結(jié)果偏高或偏低，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。本文就不同膽紅素水平對(duì)HBV DNA定量檢測(cè)的影響及如何去除膽紅素因素干擾作一些探討。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源分別收集乙肝兩對(duì)半全陰性、HBV DNA陰性、膽紅素正常的混合血清(膽紅素正常血清)和乙肝兩對(duì)半全陰性、HBV DNA陰性、高膽紅素的混合血清(高膽紅素血清)，收集2013年1月至5月門診及住院乙肝患者的高膽紅素血清5例，其中男患者4例，年齡介于31~62歲之間，女患者1例，年齡61歲。

1.2試劑與儀器HBV DNA定量檢測(cè)試劑購(gòu)自上海復(fù)興醫(yī)學(xué)科技有限公司，儀器為羅氏公司Lightcycler 480Ⅱ。膽紅素檢測(cè)試劑購(gòu)自寧波美康，儀器為日本Olympus AU5400全自動(dòng)生化分析儀。

1.3檢測(cè)方法⑴將不同濃度的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品（S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml）按相同比例分別添加到膽紅素正常血清和高膽紅素血清中，按不同濃度膽紅素進(jìn)行分組來(lái)考察不同濃度膽紅素血癥對(duì)HBV DNA測(cè)定結(jié)果的影響程度大小，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)三次，同時(shí)觀察擴(kuò)增曲線是否存在差異。⑵將擴(kuò)增曲線異常的高膽紅素血清用膽紅素正常血清進(jìn)行稀釋，加入HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品，再分別測(cè)定HBV DNA的結(jié)果，確定多少濃度以下的膽紅素對(duì)HBV DNA檢測(cè)不產(chǎn)生影響。⑶將高膽紅素血清作10、100、1000倍稀釋，進(jìn)行檢測(cè)。⑷將臨床收集的5例高膽紅素的乙肝血清標(biāo)本進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)，并作稀釋后檢測(cè)。⑸熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA含量，化學(xué)氧化反應(yīng)檢測(cè)血清總膽紅素。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度水平總膽紅素血清HBV DNA檢測(cè)結(jié)果血清膽紅素濃度介于401~500μmol/L、501~ 600μmol/L、>600μmol/L三個(gè)組，HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果高于膽紅素正常血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），血清膽紅素濃度濃度介于20.6~100μmol/ L、101~200μmol/L、201~300μmol/L和301~400μmol /L四個(gè)組，與膽紅素正常血清組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。血清膽紅素濃度高于400μmol/L血清擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增曲線先緩慢升高，其基線高于標(biāo)準(zhǔn)品，其閾值線處于拐點(diǎn)之下非S擴(kuò)增區(qū)，定值偏高；之后升高呈現(xiàn)S型曲線，但其斜率低于標(biāo)準(zhǔn)品，見圖1。

表1　不同水平總膽紅素血清HBV DNA測(cè)定結(jié)果比較(logC±s)

圖1　高膽紅素血清擴(kuò)增曲線

2.2對(duì)高膽紅素血清進(jìn)行倍比稀釋后的結(jié)果將高膽紅素患者血清作原倍及10、100、1000倍稀釋后測(cè)定HBV DNA含量，結(jié)果10倍稀釋后擴(kuò)增曲線斜率即接近標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，10、100、1000倍稀釋后擴(kuò)增曲線平行且等間距，結(jié)果一致性較好，見圖2。

圖2　高膽紅素血清原倍、10、100、1000倍稀釋后擴(kuò)增曲線

2.3臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果5例高膽紅素血清有4例在定閾值線時(shí)，其閾值線處于拐點(diǎn)之下非S擴(kuò)增區(qū)，定值偏高，結(jié)果高于稀釋后的標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；有1例閾值線處于拐點(diǎn)處，其斜率低于標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果低于稀釋后的標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 5例高膽紅素血清用正常血清作10倍和2倍稀釋制備總膽紅素含量介于3.4~ 100μmol/L、101 ~400μmol/L，對(duì)兩組血清HBV DNA結(jié)果進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2　臨床高膽紅素血清標(biāo)本HBV DNA測(cè)定結(jié)果比較

3　討論

對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR準(zhǔn)確性造成影響的因素很多，任何能影響PCR擴(kuò)增的因素均可影響其擴(kuò)增的效率及定量的準(zhǔn)確度。除了PCR本身因素及反應(yīng)體系外，樣本狀態(tài)亦可能對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生影響，臨床上經(jīng)常會(huì)遇到溶血、黃疸和脂血等血清樣本，本研究為著重了解膽紅素對(duì)HBV DNA檢測(cè)的影響，故在收集試驗(yàn)樣本時(shí)已對(duì)溶血、脂血樣本進(jìn)行排除篩選。

正常人血清總膽紅素水平在3.4-20.5μmol/L之間，高膽紅素血癥在臨床較為常見，如急慢性肝性疾病、新生兒黃疸等患者，其血清中總膽紅素濃度常明顯升高，高膽紅素血影響許多臨床檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)總膽紅素高于400μmol/ L，將影響熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA含量，對(duì)擴(kuò)增有干擾，影響結(jié)果的定值。高膽紅素血清擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增曲線先緩慢升高，其基線高于標(biāo)準(zhǔn)品，之后升高呈現(xiàn)S型曲線，但其斜率低于標(biāo)準(zhǔn)品，如閾值線處于緩慢升高期，定值不準(zhǔn)確，如閾值線抬高至S型曲線拐點(diǎn)處，其斜率低于標(biāo)準(zhǔn)品曲線，這樣將導(dǎo)致定值結(jié)果偏低。而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，黃疸對(duì)于HBV DNA檢測(cè)無(wú)影響。這可能與使用不同廠家生產(chǎn)的試劑盒對(duì)核酸檢測(cè)靈敏度不一樣、對(duì)黃疸標(biāo)本中的膽紅素處理能力不一樣有關(guān)。

在檢測(cè)中應(yīng)盡可能消除膽紅素的干擾作用，目前可用化學(xué)方法氧化分解膽紅素后再進(jìn)行測(cè)定，另外還可以用特異性膽紅素吸附劑吸附膽紅素來(lái)減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，但尚未用于臨床檢測(cè)[10-15]。本文對(duì)于高膽紅素血清采用陰性稀釋后再檢測(cè)HBV DNA含量發(fā)現(xiàn)，膽紅素對(duì)于HBV DNA檢測(cè)的干擾已大大減低，其擴(kuò)增曲線斜率已與標(biāo)準(zhǔn)品曲線一致。10、100、1000倍稀釋后擴(kuò)增曲線平行且等間距，結(jié)果一致性較好，因此，在重度黃疸血清測(cè)定HBV DNA時(shí)，如僅采用2倍稀釋，可能膽紅素濃度仍會(huì)過高，影響測(cè)定；采用10倍稀釋即可將膽紅素濃度降至100μmol/L以下，降低了對(duì)擴(kuò)增的干擾。

通過不同水平膽紅素對(duì)熒光定量PCR測(cè)定HBV DNA的探討，建議臨床各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試劑性能評(píng)價(jià)時(shí)，設(shè)立適合本實(shí)驗(yàn)室的膽紅素評(píng)價(jià)試驗(yàn)，制定適合本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本檢測(cè)程序。

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·論著·

中圖分類號(hào)：R446.11+2，R512.6+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)03-0283-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.008

基金項(xiàng)目：鹽城市科技立項(xiàng)課題，編號(hào)YK2015002

作者簡(jiǎn)介：崔蕾蕾，女，1980年9月生，碩士，副主任檢驗(yàn)技師，主要研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)和分子生物學(xué)。

(收稿日期2016-01-27；修回日期2016-03-23)

Effect of bilirubin on the detection of HBV DNA

CUI Leilei，SHAO Keke，Zuo Yueyuan. Department of Laboratory Medicine，the First People’s Hospital of Yancheng City，Jiangsu Yancheng 224000，China.

Abstract：Objective To investigate the effect of high level of serum bilirubin on detection of hepatitis B virus DNA (HBVDNA) by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)，and select the effective method to reduce the interference of bilirubin on HBV-DNA detection. Methods The different concentrations of HBV-DNA standard products (S1-S4：3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104IU/ml) were added into the serums which contained normal and high concentration of bilirubin，according to the same proportion. The effect of different concentrations of bilirubin on the determination results of HBV-DNA were investigated. Then the detection of HBV-DNA in each serum sample were performed in triplicate，and the difference of the amplification curves was observed. The serum samples diluted by 10，100 and 1000 times were tested，respectively. The serum samples from 5 cases of clinical high bilirubin were collected and used to result validation. Results The level of HBV-DNA in the serums contained bilirubin with the concentrations in 401-500μmol/L，501-600μmol/L，>600μmol/L were significantly higher than that in normal bilirubin group (P<0.05)；compared with normal bilirubin group，there is no siginificant differrence in the level detected of HBV-DNA in serum contained bilirubin with the concentrations in 20.6-100μmol/L，101-200μmol/L，201-300μmol/L and 301-400μmol/L. When the concentration of bilirubin is higher than 400μmol/L，the amplification curve raised slowly at first，and the baseline was higher than the standard. The threshold line was under the inflection point. Subsequently the amplification curve raised as S curve；for the serum samples diluted by 10，100 and 1000 times，the amplification curve was parallel and equal spaced，and the results were consistent. Among 5 clinical cases detected，4 cases presented the threshold line under the inflection point in the non-amplification region of S curve，and the detection results were significantly higher than the samples diluted (P<0. 05)；1 case presented the threshold line through the inflection point in amplification curve，the slope of which was lower than the standard curve，and the detection result was significantly lower than the sample diluted (P<0.05). Conclusion The high level of serum total bilirubin (>400μmol/L) could interfere detection of HBV DNA in fluorescence quantitative PCR，and the interference effect of bilirubin could be reduced by dilution.

Key words：Fluorescence quantitative PCR；HBV-DNA；Bilirubin