劉瑾李文輝翟光勝作者單位：655000　　曲靖　云南省曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科；6500　　昆明　云南省腫瘤醫(yī)院放療科；55000　　淄博　山東省淄博市人民醫(yī)院腫瘤科

茜草醇提物對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護作用的研究

劉瑾1李文輝2翟光勝3
作者單位：655000曲靖1云南省曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科；650031昆明2云南省腫瘤醫(yī)院放療科；255000淄博3山東省淄博市人民醫(yī)院腫瘤科

【摘要】目的 研究茜草醇提物對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護作用。方法 建立輻射損傷小鼠模型，將50只小鼠隨機分為5組，每組10只。給藥組小鼠予以不同劑量［低劑量0.25 g/（kg·d）、中劑量0.49 g/（kg·d）、高劑量0.99 g/（kg·d）］茜草醇提物灌胃，空白對照組和單純照射組分別予1 mL生理鹽水灌胃，各組持續(xù)灌胃13 d，正常飼養(yǎng)7 d后處死小鼠。于灌胃第7天，不同劑量給藥組和單純照射組小鼠均接受60Co γ射線6 Gy一次性全身照射。觀察茜草醇提物對輻射損傷小鼠體重以及外周血白細胞、紅細胞、血小板和骨髓有核細胞含量的影響。結(jié)果 與單純照射組比較，高劑量茜草醇提物給藥+照射組小鼠外周血白細胞、紅細胞、骨髓有核細胞計數(shù)均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但體重和血小板計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而低劑量、中劑量茜草醇提物給藥+照射組與單純照射組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 高劑量茜草提取物對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)有促進恢復作用。

【關(guān)鍵詞】茜草；灌胃；輻射損傷；造血系統(tǒng)；保護作用

茜草（Rubia Cordifolia L）是茜草科茜草屬多年生草本植物的干燥根及根莖，在我國有悠久的藥用歷史［1］。茜草提取物有止血、抗血小板聚集、升白細胞、抗氧化、抗輻射、誘導癌細胞凋亡以及提高機體免疫力等作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)茜草對各類癌細胞有一定抑制作用［3］。本研究主要探討茜草醇提物對放療致小鼠造血系統(tǒng)損傷的防護作用及其最佳劑量。

1　　材料與方法

1.1實驗動物

健康SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，6～8周齡，由昆明醫(yī)學院實驗動物中心提供。1.2試劑及儀器

60Co遠距離治療機（國產(chǎn)，型號：GWGP80），血細胞計數(shù)儀（Sysmex公司，型號：KX-21N），分光光度計（Kyoto公司，型號：UV-190），高速水平離心機（國產(chǎn)，型號：TGL-168），電子天平（Sartorius公司，型號：BP310S），普通光學顯微鏡（Olympus公司，型號：CX-31），烘箱（國產(chǎn)，型號：2002020001）。

1.3藥物提取

茜草由云南省中醫(yī)中藥研究所提供，由云南大學天然藥物教研室進行藥物提取，步驟如下：⑴將茜草（小紅參）1 000 g浸泡于4 000 mL 70%乙醇24 h，然后置于蒸餾瓶中，80℃水浴加熱低壓回流4 h，冷卻過濾得濾液。⑵藥渣中加入4 000 mL乙醇，80℃水浴加熱回流4 h，冷卻過濾得濾液。⑶重復加乙醇加熱回流得2次濾液，合并以上4次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至浸膏，放入80℃烘箱烘干至恒重，取出藥物，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實驗分組及給藥劑量

按動物體表面積比率換算等效劑量法計算茜草醇提物給藥劑量，方法參照文獻［4］，其中低劑量為0.25 g/（kg·d）、中劑量為0.49 g/（kg·d）高劑量為0.99 g/（kg·d）。采用云南省腫瘤醫(yī)院放療中心60Coγ射線給予各照射組小鼠亞致死劑量6 Gy一次性全身照射，照射野25 cm×25 cm，源皮距100 cm。50只小鼠按體重隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組（control組）、單純照射組（IR組）、低劑量茜草醇提物給藥+照射組（IR+LD組）、中劑量茜草醇提物給藥+照射組（IR+MD組）、高劑量茜草醇提物給藥+照射組（IR+HD組），各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.5實驗流程

實驗第1天將各組小鼠稱重，并做好標記。IR+ LD組、IR+MD組和IR+HD組小鼠予以相應(yīng)低劑量、中劑量、高劑量茜草醇提物灌胃，control組和IR組小鼠予1 mL生理鹽水灌胃，各組小鼠持續(xù)灌胃13 d。灌胃第7天，4個照射組小鼠接受60Co γ射線6 Gy一次性全身照射，且分別于第1天（照射前）和第12天（照射后6 d）將各組小鼠稱重后斷尾取血送檢；第二次取血（照射后6 d）后正常飼養(yǎng)7 d，第20天（照射后13 d）再次將各組小鼠稱重后斷尾取血送檢，頸椎脫椎處死小鼠。

1.6觀察指標

1.6.1體重自實驗開始每天10：00將小鼠置于電子天平稱重，做好記錄。

1.6.2血象分析分別于第1天（照射前）、第12天（照射后6 d）和第20天（照射后13 d）將小鼠斷尾取血，每次取血量約為250 μL，滴入抗凝管內(nèi)，采用全自動血細胞計數(shù)儀檢測白細胞、紅細胞、血小板含量，并記錄結(jié)果。

1.6.3骨髓有核細胞計數(shù)處死小鼠后，取一側(cè)股骨，剝離肌肉組織，按小鼠編號將股骨放入2 mL EP管中，用RPMI-1640液反復沖洗骨髓，將沖出的骨髓液用微量移液器吸取，通過濾布過濾至另一編號相同的EP管中，采用全自動血細胞計數(shù)儀行骨髓有核細胞計數(shù)。

1.7統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗。以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　　結(jié)果

2.1不同劑量茜草醇提物對小鼠體重的影響

照射前各組小鼠體重均衡，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。照射后3 d、5 d、8 d、13 d，IR組、IR+LD組、IR+MD組和IR+HD組小鼠體重持續(xù)增加，但與control組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各照射組中，IR組小鼠體重增長速度最慢，個別小鼠體重降低；IR+HD組小鼠體重增加最快，IR組與各給藥組小鼠體重差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠體重的影響［（±s）g］

表1　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠體重的影響［（±s）g］

與control組比較，*P＜0.05。

組別　　照射前照射后3 d　5 d　8 d　13 d control組　21.17±1.24　26.75±1.16　27.56±1.18　27.96±2.10　30.98±1.61 IR組　21.19±1.49 21.33±1.81*22.94±1.22*23.80±1.47*24.18±1.55*IR+LD組　20.57±0.90 22.68±1.23*23.17±1.09*23.91±1.22*24.93±1.90*IR+MD組　21.25±1.36 22.65±1.27*23.57±0.98*24.81±1.18*25.75±1.31*IR+HD組20.55±0.69 22.94±1.70*23.85±1.55*24.76±1.01*26.24±1.27*

2.2不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠白細胞計數(shù)的影響

照射前各組小鼠白細胞數(shù)均衡，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。照射后6 d，各照射組小鼠白細胞數(shù)顯著下降，均達到最低值，其中IR+HD組下降最緩慢；至照射后13 d，各照射組小鼠白細胞數(shù)緩慢回升，其中IR+HD組回升最明顯。照射后6 d和照射后13 d各照射組與control組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），IR+HD組與IR組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但IR+LD組和IR+MD組與IR組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠白細胞計數(shù)的影響［（±s）×109/L］

表2　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠白細胞計數(shù)的影響［（±s）×109/L］

與control組比較，*P＜0.01；與IR組比較，▲P＜0.05。

組別　　照射前照射后6 d　13 d control組　5.3±1.42　6.11±1.17　6.26±1.48 IR組　5.15±0.73　1.13±0.18*　1.25±0.39*IR+LD組　5.38±0.50　1.37±0.53*　1.45±0.16*IR+MD組　5.36±0.76　1.74±0.50*　1.92±0.30*IR+HD組　5.32±0.57　2.89±0.42*▲　3.54±0.32*▲

2.3不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠紅細胞計數(shù)的影響

照射前各組小鼠紅細胞數(shù)均衡，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。照射后6 d，各照射組小鼠紅細胞數(shù)明顯下降，均達到最低值，其中IR+HD組小鼠紅細胞下降較緩慢；照射后13 d，各照射組小鼠紅細胞緩慢增長，其中IR+HD組小鼠增長最快，IR組回升緩慢。照射后6 d和照射后13 d，各照射組與control組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），IR+HD組與IR組比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但IR+LD組和IR+MD組與IR組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠紅細胞計數(shù)的影響［（±s）×1012/L］

表3　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠紅細胞計數(shù)的影響［（±s）×1012/L］

與control組比較，*P＜0.01；與IR組比較，▲P＜0.05。

組別　　照射前照射后6 d　13 d control組　7.98±0.65　8.24±0.49　8.44±0.80 IR組　7.96±0.91　5.29±0.47*　5.58±0.40*IR+LD組　7.89±0.67　6.12±0.63*　6.59±0.46*IR+MD組　7.92±0.41　6.38±0.73*　6.81±0.57*IR+HD組　8.12±0.42　7.25±0.43*▲　7.80±0.64*▲

2.4不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠血小板計數(shù)的影響

照射前各組小鼠血小板計數(shù)均衡，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。照射后6 d和13 d，各照射組小鼠血小板計數(shù)持續(xù)下降，至照射后13 d達到最低值，其中IR組下降最顯著，IR+HD組下降最緩慢。各照射組與control組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而各給藥組與IR組比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠血小板計數(shù)的影響［（±s）×109/L］

表4　　不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠血小板計數(shù)的影響［（±s）×109/L］

與control組比較，*P＜0.05。

組別　　照射前照射后6 d　13 d control組　671±61.6　684.4±57.1　697±75.1 IR組　663.9±52.9　493.8±61.5*　378±50.7*IR+LD組　673.4±73.7　518.2±51.8*　427.1±57.2*IR+MD組　675.2±66.2　536.1±83.53*　433.7±52.2*IR+HD組　691.8±54.4　542.1±72.6*　451.8±55.6*

2.5不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠骨髓有核細胞計數(shù)的影響

照射后13 d，control組、IR組、IR+LD組、IR+MD組和IR+HD組小鼠骨髓有核細胞計數(shù)分別為（117.6±17.9）×105個/根、（75±8.27）×105個/根、（87± 11.2）×105個/根、（99±9.1）×105個/根和（105.9±9.4）× 105個/根。各照射組小鼠骨髓有核細胞數(shù)明顯下降，其中IR組最低，而IR+HD下降最緩慢，各照射組與control組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與IR組比較，IR+LD組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而IR+ MD組、IR+HD組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　　討論

中藥作為輻射防護劑已進行了大量研究并取得一定成效。黃榮清等［5］在實驗中分離出的RPS-1 （108）、RPS-2（109）和RPS-3（110）3種茜草多糖，其中RPS-2、RPS-3對游離的自由基有明顯的拮抗作用，對自由基的清除率大于93%，是抗氧化的主要成分。而藥理實驗［6］證實茜草中性多糖和酸性多糖對放療受照小鼠的造血組織有一定保護作用，其多糖成分作為抗輻射藥品具有良好的前景。以上研究提示茜草可能為一種抗輻射效果較好的中藥，本研究以不同劑量茜草醇提物對輻射損傷小鼠予以灌胃，以期觀察其對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的防護作用。

體重、皮膚和精神狀態(tài)是反映小鼠一般狀況的基本指標，照射后小鼠體重的下降、體毛及皮膚的變化一定程度上反映了其受損的嚴重程度［6～8］。本實驗中，空白對照組小鼠皮毛光滑，活潑好動，飲食正常，體重逐漸增加。而各照射組小鼠精神萎靡，進食緩慢，飲水減少，皮毛粗糙，脫毛，嚴重者粗糙變硬，體重均有不同程度下降，直至照射后5 d，小鼠體重才逐漸停止下降，緩慢恢復增長；至實驗結(jié)束時，各照射組小鼠體重相當，其中高劑量給藥組小鼠體重增長速度最快，但各照射組與空白對照組相比仍有較大差距。說明60Co γ射線6 Gy一次性全身照射對小鼠造成較大損傷，且修復時間較長，而高劑量茜草醇提物給藥可促進輻射損傷小鼠體重的恢復。

機體的組織器官因其細胞組成不同，對放療的敏感性亦有差異，一般而言，細胞的更新生長速度越快，其構(gòu)成的器官組織對放療越敏感。機體的造血細胞由于更新迅速、分化程度低而對放療較敏感。在發(fā)育過程中，造血干細胞生存關(guān)鍵基因的缺失可影響正常造血［9］。Wang等［10］報道造血干細胞分裂更新的速度是評估造血系統(tǒng)放療損傷的主要指標，而氧化應(yīng)激水平升高是介導亞致死劑量（6～6.5 Gy）受照射小鼠造血干細胞衰老、骨髓長期抑制的主要機制。骨髓造血功能受損程度可由外周血細胞數(shù)量或骨髓有核細胞計數(shù)來反映，放療后機體對大量成熟細胞的消耗及骨髓有核細胞迅速凋亡可使骨髓有核細胞數(shù)量急劇減少，應(yīng)用輻射防護劑可以減輕放療后外周血細胞的下降或加速外周血細胞的恢復［11，12］。本實驗以昆明種小鼠為模型，以不同劑量茜草醇提物灌胃6 d后給予各照射組小鼠60Co γ射線6 Gy一次性全身照射，照射后6 d檢測，結(jié)果顯示各照射組小鼠白細胞、紅細胞、血小板和骨髓有核細胞計數(shù)較空白對照組均顯著下降，表明動物急性放射性損傷模型建立成功。各給藥組隨著給藥劑量的增加，各系血細胞含量亦增多，其中高劑量給藥組下降最緩慢，恢復最快，且白細胞、紅細胞、骨髓有核細胞計數(shù)較單純照射組均明顯升高，但血小板計數(shù)無顯著性差異。說明連續(xù)高劑量茜草醇提物灌胃給藥對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)有一定防護作用，并有促進外周血白細胞、紅細胞增長的作用。其作用機制可能與茜草中的多糖成分提高了照射細胞的抗氧化能力，清除自由基的生成有關(guān)。此外，茜草為補氣益血中藥，作用于骨髓造血組織，可促進放療損傷小鼠骨髓造血干細胞修復、分化及增殖，進而促進各類分化成熟細胞從骨髓向外周釋放［1］。

本研究未發(fā)現(xiàn)茜草醇提物對血小板生長的促進作用，推測可能與血小板的生長發(fā)育機制與本實驗觀察時間不足有關(guān)。血小板的平均壽命為7～14 d，每日凋亡數(shù)量約占總量的1/10，在照射初期，未受損的成熟巨核細胞仍有生成血小板的能力，因此在照射后一周內(nèi)，外周血中的血小板下降緩慢，隨后因照射受損的成熟巨核細胞逐漸增加，生成血小板能力銳減，血小板數(shù)量出現(xiàn)進行性下降，至實驗結(jié)束時達到最低水平。因本實驗的觀察時間較短，血小板是否恢復有待進一步研究。

綜上所述，本實驗初步發(fā)現(xiàn)茜草醇提物對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)有一定防護作用，其機制可能與茜草中的多糖成分提高了照射細胞的抗氧化能力，清除自由基的生成，以及促進骨髓造血干細胞損傷修復、分化及增殖相關(guān)，具體作用機制有待進一步研究。

參考文獻

［1］ 王靜，王晉，高榮，等.茜草提取方法及其活性成分的藥理作用研究［J］.疾病監(jiān)測與控制雜志，2012，6（4）：225-226.

［2］ Fan JT，Chen YS，Xu WY，et al.Rubiyunnanins C-H，cytotoxic cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensis inhibiting nitric oxide production and NF-B activation［J］.Bioorg Med Chem，2010，18（23）：8226-8234.

［3］ 王艷雙，羅速，崔新穎，等.茜草抗腫瘤作用及其機制研究［J］.北華大學學報（自然科學版），2005，6（6）：499-504.

［4］ 浦益瓊，王冰，張彤，等.茜草提取物中大葉茜草素測定的方法研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：94-96.

［5］ 黃榮清，王作華，王紅霞，等.茜草多糖RPS-1、RPS-2和RPS-3組成研究［J］.中藥材，1996，19（1）：25-26.

［6］ 陳寅生，李武營.茜草中多糖成分的提取分離與抗輻射作用的實驗研究［J］.河南大學學報（醫(yī)學版），2004，23（1）：32-34.

［7］Palmer JL1，Deburghgraeve CR，Bird MD，et al.Development of a combined radiation and burn injury model［J］.J Burn Care Res，2011， 32（2）：317-323.

［8］ Kinoshita N，Tsuda M，Hamuy R，et al.The usefulness of basic fibroblast growth factor for radiation-exposed tissue［J］.Wound Repair Regen，2012，20（1）：91-102.

［9］ Gurumurthy S，Xie SZ，Alagesan B，et al.The LKb1 metabolic sensor maintains haematopoietic stem cell survival［J］.Nature，2010，468 （7324）：659-663.

［10］Wang Y，Liu L，Pazhanisamy SK，et al.Total body irradiation causes residual bone marrow injury by induction of persistent oxidative stress in murine hematopoietic stem cells［J］.Free Radic Biol Med，2010，48（2），348-356.

［11］ Xu W，Shen X，Yang F，et al.Protective effect of polysaccharides isolated from Tremella fuciformis against radiation-induced damage in mice［J］.J Radiat Res，2012，53（3）：353-360.

［12］Cui F，Li M，Chen Y，et al.Protective effects of polysaccharides from Sipunculus nudus on Beagle dogs exposed to γ-radiation［J］.PLoS One，2014，9（8）：e104299.

［2015-12-28收稿］［2016-03-23修回］［編輯羅惠予］

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1674-5671（2016）03-05

DOI：10.3969/j.issn.1674-5671.2016.03.03

【通信作者】劉瑾。E-mail：clover006@163.com

Rubiayunnanensis protects against radiation-induced hematopoietic damage in mice

Liu Jin1，Li Wenhui2，Zai Guangsheng3（1Department of Oncology，the First People′s Hospital of Qujing，Yunnan Province，Qujing 655000，P.R.China；2Departmentof Radiotherapy，the Tumor Hospital of Yunnan Province，Kunming 650031，P.R.China；3Department of Oncology，the People′s Hospital of Zibo，Shandong Province，Zibo 255000，P.R.China）
Corresponding author：Liu Jin.E-mail：clover006@163.com

【Abstract】Objective To explore the protective effects of rubiayunnanensis on the hematopoietic system of mice irradiated with60Co γ-rays.MethodsA mouse model of radiation damage was established and used to probe the protective effects of rubiayunnanensis.Mice were randomly divided into five groups（n=10 animals per group）：mice were given low，intermediate or high doses of an alcohol extract of madder by continuous gavage for 12 d；irradiation alone and control mice were given 1 mL normal saline.At 7 d after gavage began，all irradiation groups were irradiated with 6 Gy60Co γ-rays and allowed to live another 12 days，then sacrificed.Body weight；counts of erythrocytes，leukocytes，and platelets in peripheral blood；and numbers of karyota in femur were measured.Results Erythrocyte and leukocyte counts were significantly higher in animals treated with high-dose rubiayunnanensis than in irradiation alone animals（P＜0.05），while body weight and platelet counts tended to be higher in the highdose animals.No significant differences were observed between irradiation alone animals or animals treated with low or intermediate doses of rubiayunnanensis.Conclusions High doses of rubiayunnanensis may promote the recovery of hematological function of mice irradiated with60Co γ-rays.

【Key words】Rubiayunnanensis；Gavage；Radiation injury；Hematopoietic system；Protective effects