秦 敏，郝俊虎，祝 賀，鄒豐才，楊云慶，楊 素，葉玲玲，張永寧，周曉黎，艾 軍（.云南農業(yè)大學，云南昆明 600；.寧夏出入境檢驗檢疫局，寧夏銀川 7000；.云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明 608；.珠海出入境檢驗檢疫局，廣東珠海 90；.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 0009）

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施馬倫貝格病毒核蛋白在昆蟲細胞中的表達

秦 敏1，郝俊虎2，祝 賀3，鄒豐才1，楊云慶3，楊 素4，葉玲玲3，張永寧5，周曉黎3，艾 軍3
（1.云南農業(yè)大學，云南昆明 650201；2.寧夏出入境檢驗檢疫局，寧夏銀川 750002；3.云南出入境檢驗檢疫局，云南昆明 650228；4.珠海出入境檢驗檢疫局，廣東珠海 519015；5.中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100029）

摘 要：參照NCBI公布的施馬倫貝格病毒（SBV）的N基因開放閱讀框序列，設計了一對含特異性酶切位點的引物，擴增SBV N基因，將其克隆于昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacHTB，然后以該重組質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，得到重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N，將該重組穿梭質粒在脂質體介導下轉染Sf 9昆蟲細胞，得到表達SBV重組N蛋白的桿狀病毒。通過SDS-PAGE和Western blot對重組N蛋白進行鑒定，表明該蛋白得到表達。本研究為以SBV核蛋白為基礎的相關檢測方法的建立提供了物質基礎。

關鍵詞：施馬倫貝格病毒；核蛋白；桿狀病毒；昆蟲細胞；表達

施馬倫貝格病（SB）是一種新發(fā)動物傳染病，病原為施馬倫貝格病毒（SBV），屬于布尼亞病毒科、正布尼亞病毒屬。正布尼亞病毒直徑為80～120 nm，其基因組分為大（L）、中（M）、?。⊿）3 個RNA節(jié)段，長度分別為6.5 kb、4.5 kb、1 kb，其總分子質量約為（6～7）×106ku。S節(jié)段編碼為核衣殼蛋白（N）和非結構蛋白（NS）；M節(jié)段編碼為多聚糖蛋白，可被宿主蛋白酶切割成Gn、Gc蛋白；L節(jié)段編碼為病毒RNA依賴的RNA聚合酶L蛋白。其中N蛋白由702個核苷酸編碼，分子質量約為25.6 ku［1-2］。

2011年11月，SBV首次從德國的病奶牛（發(fā)熱，奶量減少）中被分離到。2012年12月初，荷蘭發(fā)現(xiàn)新生羔羊出現(xiàn)先天性畸形，并從羔羊的腦組織中檢測和分離出SBV。截至2014年5月，德國、荷蘭、比利時、瑞士、英國、法國、盧森堡和意大利等國家陸續(xù)檢測出SBV陽性樣品，而在歐洲以外的國家和地區(qū)未見報道。

SBV可引起牛、山羊、綿羊、野牛等動物發(fā)病，主要通過庫蠓傳播，也可通過胎盤垂直傳播。SB主要的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、乏力、產死胎和畸形胎、產奶量下降、新生幼畜先天缺陷等，嚴重影響牲畜生產性能，危害畜牧業(yè)發(fā)展［3］。歐洲是我國種畜引進及畜產品進口的主要來源地區(qū)之一，基于SBV可能對我國畜牧業(yè)帶來的風險，研究該病毒的檢測方法具有重要意義。本研究通過將SBV N基因重組于昆蟲桿狀病毒表達載體，并將其在昆蟲細胞中表達，表達蛋白的獲得可為該病毒檢測方法的研究奠定物質基礎。

1　材料與方法

1.1菌種、質粒、細胞

SBV-N質粒（攜帶SBV N基因的重組質粒）、針對SBV N蛋白的單抗1F2、兩種SBV N純化蛋白（帶組氨酸標簽的融合蛋白His-SBV-N，蛋白分子量約30KD及帶麥芽糖結合蛋白標簽的融合蛋白MBP-SBV-N，蛋白分子量約70KD）由中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所張永寧博士惠贈；pFastBacHTB質粒、Bacmid-GFP（可表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌）、Top10 E.coli和DH10Bac E.coli菌種及Sf 9細胞由云南出入境檢驗檢疫局國家級蟲媒病檢測重點實驗室保存。

1.2主要試劑

小量凝膠回收試劑盒及小量質粒提取試劑盒購自AxyGEN公司；Primer STAR HS DNA Polymerase、限制性內切酶BamH I和Pst I、T4連接酶，LA Taq酶、DNA Marker（DL2000、DL10000）購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker IV購自天根生化科技有限公司；蛋白質Marker購自Fermentas公司；胎牛血清（FBS）、Grace's 昆蟲細胞培養(yǎng)基、Cellfectin II轉染試劑盒購自Invitrogen公司；EDTA、SDS、β-巰基乙醇等購自上海生物工程公司；營養(yǎng)肉湯（LB）和營養(yǎng)瓊脂購自中國進出口商品檢驗技術研究所北京陸橋技術有限責任公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶（HRP）標記購自Southern Biotech公司；DAB顯色試劑購自TIANGEN公司。

1.3引物的設計與合成

根據SBV（GenBank登錄號：HE649914.1）堿基序列設計了一對引物用于N基因的擴增和鑒定，SBVF：5'-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3'；SBVR：5'-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'；下劃線分別為BamⅠ和PstⅠ限制性酶切位點，擴增目的片段長度為722 bp。參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)使用手冊，合成用于鑒定DH10Bac桿粒的通用引物（M13），M13 Forward：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13 Reverse：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。引物由寶生物公司合成。

1.4目的基因的擴增

以SBV-N質粒為模板、SBVF/SBVR為引物，對SBV N基因進行特異性擴增得到目的片段。

1.5克隆載體pMD18T-SBV-N的構建與鑒定

將擴增得到的目的片段與pMD18-T Vector于16℃過夜連接，將連接產物轉化到Top10感受態(tài)細胞，涂板，倒置平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取形態(tài)良好的單菌落，進行PCR并測序鑒定。

1.6質粒pMD18T-SBV-N與pFastBacHTB的提取

將凍存的含有pMD18T-SBV-N質粒的Top10 E.coli與含表達載體pFastBacHTB的Top10 E.coli復蘇后擴大培養(yǎng)，采用AxyGEN公司的小量質粒提取試劑盒提取質粒，于-20℃保存。

1.7重組供體質粒pFastBacHTB-SBV-N的構建與鑒定

將pMD18T-SBV-N與pFASTbacHTB質粒用限制性內切酶BamⅠ和PstⅠ于37℃進行雙酶切，酶切后分別回收，酶切產物用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產物轉化到Top10感受態(tài)細胞，涂板，倒置平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，挑取形態(tài)良好的單菌落，進行PCR鑒定，陽性菌提取質粒進行雙酶切、測序鑒定。

1.8重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N的構建與鑒定

重組供體質粒pFastBacHTB-SBV-N轉化DH10Bac E.coli 感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、慶大霉素（Gen）的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)良好的單菌落，用SBVF/ SBVR引物與M13引物進行PCR鑒定。

1.9重組穿梭質粒在昆蟲細胞中的表達

參照 Invitrogen Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem使用說明手冊進行轉染，將重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N和Bacmid-GFP在脂質體介導下轉染對數期生長的Sf9昆蟲細胞，其中Bacmid-GFP轉染作為陽性對照。28℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察一次細胞的生長情況，根據細胞生長情況于96～120 h左右收集細胞和培養(yǎng)液，反復凍融3次，3 000 r/min離心10 min，上清液即為重組桿狀病毒液。經傳代得到第二代病毒，用于Western blot分析，結果為陽性時可以將其分裝，凍存作種毒。

1.10重組蛋白的SDS-PAGE鑒定和Western blot分析

1.10.1SDS-PAGE鑒定。使用Bio-Rad mini電泳儀，參照Bio-Rad mini電泳儀操作手冊說明書，對重組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。同時做兩塊凝膠，一塊用于染色分析，另一塊用于Western blot分析。電泳結束后，剝離出的凝膠先用蒸餾水沖洗，再用考馬斯亮蘭染色液浸泡凝膠，放在搖床上室溫染色1h。染色完成后，用考馬斯亮蘭脫色液脫色至背景無色透明，自然光下觀察電泳結果，參照蛋白質Maker和陰性對照判斷目的蛋白是否已經表達，照相記錄實驗結果。

1.10.2Western blot分析。用Bio-Rad轉膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉移至固相載體硝酸纖維素膜上，以抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2（1：1 000稀釋）為一抗、羊抗鼠IgG-HRP（1：3 000稀釋）為二抗進行反應，進一步分析表達產物。

2　實驗結果

2.1目的基因的擴增

用引物SBVF/SBVR對SBV-N質粒進行擴增，在722 bp處出現(xiàn)單一條帶（圖1），大小與理論值相符。

圖1　重組質粒SBV-N的PCR擴增

2.2克隆載體pMD18T-SBV-N的鑒定

重組質粒pMD18T-SBN-N用引物SBVF/SBVR進行PCR初步鑒定，擴增產物為722 bp（圖2），與理論值相符。

圖2　重組質粒pMD18T-SBV-N的PCR擴增

2.3重組供體質粒pFastBacHTB-SBV-N的鑒定

重組質粒pFastBacHTB-SBV-N經BamⅠ和PstⅠ雙酶切，切出722 bp的SBV N目的基因條帶（圖3），大小與預期結果相符，進一步測序結果證實插入的外源目的片段大小及核酸序列是正確的，證明已成功構建了重組供體質粒pFastBacHTB-SBV-N。

2.4重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定

pFastBacHTB-SBV-N轉入DH10Bac感受態(tài)細胞后，經Gen、Kan、Tet 3種抗生素平皿篩選后，提取其DNA，用引物SBVF/SBVR進行PCR鑒定，擴增產物為722 bp（圖4）；用M13正向和反向引物進行PCR鑒定，擴增產物為3 152 bp（圖5），結果證明轉座成功，獲得重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N。

圖4　重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N的PCR擴增

2.5重組蛋白在昆蟲細胞中的表達

提取轉座桿粒DNA，在脂質體介導下轉染對數期生長的Sf 9昆蟲細胞，同時以表達綠色熒光蛋白的Bacmid-GFP作為轉染時的陽性對照，28℃培養(yǎng)48 h左右，在倒置顯微鏡下可見細胞病變，與正常細胞相比，轉染細胞變大、變圓（圖6a和6b）。轉染Bacmid-GFP的昆蟲細胞在24 h后可觀察到熒光蛋白（圖6c），轉染120 h后，表達熒光蛋白的細胞達80%以上（圖6d）。根據熒光蛋白的表達情況，可估計最佳的病毒收獲時間。

圖5　重組質粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定

圖6　重組蛋白在Sf9昆蟲細胞上表達（顯微鏡觀察倍數：10×16）

2.6重組蛋白的表達鑒定

將重組穿梭質粒Bacmid-SBV-N和陽性對照Bacmid-GFP轉染對數期生長的sf 9昆蟲細胞，于28℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96～120 h左右，收集細胞培養(yǎng)液作為種毒。對經傳代得到的第二代病毒（Vbacmid-SBV-N）進行SBV核蛋白的表達鑒定。SDS-PAGE和Western blot鑒定結果均表明，重組蛋白成功表達，蛋白分子量約為29.6KD（圖7a、圖7b）。

圖7　重組蛋白的表達鑒定

3　討論

SBV是一種新發(fā)動物蟲媒病毒，傳播速度快［4］。自2011年首次在德國被發(fā)現(xiàn)后，已引起全球動物疫病防控部門的高度重視，許多國家已開展了SBV檢測方法的技術儲備研究。其中涉及SBV病毒核酸檢測方法的，有德國FLI 實驗室推薦的熒光PCR檢測方法、中國檢科院建立的LAMP檢測方法等；涉及SBV血清抗體檢測的，有中和試驗、間接ELISA、競爭ELISA方法。在血清抗體檢測方法的研究中，尚未見將在昆蟲表達的SBV核蛋白用于其ELISA檢測。

SBV的N蛋白是布尼亞病毒科病毒的主要結構蛋白，廣泛存在于被病毒感染的動物組織和細胞中［5］。目前，N蛋白已成為SBV分子生物學和血清學檢測的理想靶抗原［1，6-7］。在我國，中國檢科院動物檢疫研究所先后利用原核表達系統(tǒng)表達了SBV N蛋白，分別制備了組氨酸標記和麥芽糖標記的融合SBV N蛋白［8-9］。

本研究基于昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)優(yōu)于原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點——表達外源蛋白時具有完備的翻譯后加工修飾能力，開展了SBV核蛋白在昆蟲細胞中的表達。在表達SBV蛋白的過程中，為了控制轉染過程中因試劑、操作等因素造成的誤差，在轉染時，以實驗室前期構建的Bacmid-GFP作為陽性對照，轉染后通過觀察綠色熒光蛋白的表達來驗證轉染過程的可靠性；在表達蛋白的電泳、免疫印跡試驗中，以中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所張永寧博士惠贈的原核表達系統(tǒng)表達的SBV N蛋白作為參照［9］，進行表達蛋白的鑒定。通過鑒定，本研究獲得了昆蟲細胞表達的SBV N蛋白，今后還將進行表達蛋白的穩(wěn)定性、特異性、敏感性研究，以期獲得的表達蛋白能作為SBV ELISA檢測方法建立中包被抗原的候選物質。

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（責任編輯：胡藕祥）

中圖分類號：S852.65+9.5

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）01-0076-05

基金項目：國家質檢總局科技項目（2013IK050），國家科技支撐計劃項目（2013BAD12B03）

通訊作者：郝俊虎，艾軍

Expression of NP Gene of Schmallenberg Virus in Insect Cells

Qin Min1，Hao Junhu2，Zhu He3，Zou Fengcai1，Yang Yunqing3，Yang Su4，Ye Lingling3，Zhang Yongning5，Zhou Xiaoli3，Ai Jun3
（1.Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650228；2. Ningxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yinchuan，Ningxia 750002；3.Technology Center of Yunnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Kunming，Yunnan 650228；4.Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai，Guangdong 519015；5.Institute of Animal Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029）

Abstract：According to the published genome sequences of Schmallenberg virus in NCBI database，a pair of specifi c primers were designed to amplify the nucleoprotein （NP）of SBV gene by PCR. The amplifi ed fragment was inserted into the baculovirus expression vector pFastBacHTB. After sequencing and analysis，the recombinant plasmid was transformed into E.coli DH10Bac. Recombinant baculovirus was achieved by transfection of the Sf9 cell with Bacmid-N. The recombinant virus was confi rmed via SDS-PAGE and western blotting，showing that N protein was expressed in infected insect cells. The expression of Schmallenberg virus N protein provided the material base to develop SBV nucleoprotein-based assays.

Key words：Schmallenberg virus；N Gene；baculovirus；insect cell；expression