趙思俊，李雪蓮，孫曉亮，曹旭敏，王淑婷，王曉茵，曲志娜（. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心/農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，山東青島6603；. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島6603）

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N-亞硝基化合物的危害及其檢測方法
——由WHO將“火腿等食品列入致癌物”談起

趙思俊1，李雪蓮2，孫曉亮1，曹旭敏1，王淑婷1，王曉茵1，曲志娜1
（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心/農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，山東青島266032；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島266032）

摘 要：為使人們正確認識加工肉制品中存在的影響人類健康安全的風險因素，本文對亞硝酸鹽等N-亞硝基化合物的化學性質(zhì)、危害特征、來源及檢測方法等進行了綜述。N-亞硝基化合物廣泛存在于熏肉（魚）、煙草、腌菜、啤酒等食品中，是一類強烈化學致癌物質(zhì)。N-亞硝基化合物主要來源于動物性食物或蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽。食品中N-亞硝基化合物的含量非常低，在檢測時需要進行樣品的提取和凈化。提取方法主要有蒸餾法、消煮法和萃取法；儀器檢測方法主要有紫外和可見光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法、膠束電動毛細管色譜法。

關(guān)鍵詞：加工肉制品；N-亞硝基化合物；危害；檢測方法；綜述

2015年10月26日，世界衛(wèi)生組織（WHO）下屬的國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）因有“充分證據(jù)”表明培根、火腿、香腸等加工肉制品可能導(dǎo)致腸癌，所以將其列為“1級致癌物”，與煙草、石棉、柴油發(fā)動機尾氣等列在同一表單。該消息的發(fā)布立即引起了全社會的高度關(guān)注，培根、火腿等加工肉制品的安全性也受到了廣大消費者的質(zhì)疑，包括我國肉類協(xié)會在內(nèi)的許多國家的相關(guān)組織、專家都對此進行了回應(yīng)［1］。加工肉制品與“致癌物”之所以有關(guān)聯(lián)，主要是因為培根、咸魚、咸肉、火腿、香腸等在加工過程中可能產(chǎn)生亞硝酸鹽，其在體內(nèi)可

N-亞 硝基 化合 物（N-Nitroso-compound，NNCs）簡稱亞硝胺，是廣泛存在于熏肉（魚）、煙草、腌菜、啤酒等食品中的一類強烈化學致癌物質(zhì)［2］。在已研究的300多種N-亞硝基化合物中，約有85%以上對動物有致癌性，可誘發(fā)動物的食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌等各種癌瘤，并且有40多種動物包括靈長類都易因攝入N-亞硝基化合物而引起癌癥。而硝酸鹽和亞硝酸鹽是腌制肉制品的成分之一，因而N-亞硝基化合物是影響動物性食品，尤其是加工肉制品的重要風險因素之一。

1　化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

按其分子結(jié)構(gòu)，N-亞硝基化合物可分成N-亞硝胺和N-亞硝酰胺二大類。N-亞硝基化合物的分子結(jié)構(gòu)通式為：

N-亞硝胺的R1和R2為烷基或芳基；低分子量的亞硝胺（如二甲基亞硝胺）在常溫下為黃色油狀液體，而高分子量的亞硝胺多為固體。二甲基亞硝胺可溶于水及有機溶劑，而其他亞硝胺均不能溶于水，只能溶于有機溶劑。N-亞硝胺在中性和堿性環(huán)境中較穩(wěn)定，但在酸性溶液及紫外線照射下可緩慢分解［3］。

N-亞硝酰胺的R1為烷基或芳基，R2為酰胺基，包括氨基甲?；?、乙氧?；跋趺谆?；兩類都可有雜環(huán)化合物。亞硝酰胺的化學性質(zhì)活潑，在酸性或堿性條件下均不穩(wěn)定。在酸性條件下可分解為相應(yīng)的酰胺和亞硝酸，在弱酸條件下主要經(jīng)重氮甲酸酯重排，放出N2和羥酸酯。在堿性條件下N-亞硝酰胺可迅速分解為重氮烷。

2　對人體的危害

N-亞硝基化合物的生產(chǎn)和應(yīng)用并不多，但其前體物亞硝酸和二級胺及酰胺廣泛存在于環(huán)境中，可在生物體外或體內(nèi)形成N-亞硝基化合物。在大氣、水體、土壤、魚、肉、蔬菜、谷類及煙草中均發(fā)現(xiàn)存在多種N-亞硝基化合物，多為液體和固體，主要經(jīng)消化道進入體內(nèi)［2-3］，屬高毒，對小鼠、豚鼠等實驗動物經(jīng)口的半數(shù)致死劑量（LD50）為150～500 mg/kg*BW（體重）。急性毒性試驗表明，N-亞硝胺主要引起肝小葉中心性出血壞死，還可引起肺出血及胸腔和腹腔血性滲出，對眼、皮膚及呼吸道有刺激作用；N-亞硝酰胺直接刺激作用強，對肝臟的損害較小，可引起肝小葉周邊性損害。

已發(fā)現(xiàn)約有200種N-亞硝基化合物對小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、猴及魚等實驗動物有致癌性，以嚙齒動物最敏感。染毒方式有吸入、氣管注入、經(jīng)口和皮下及靜脈注射，也有將亞硝酸鹽及胺等分別混于飼料及飲水種喂養(yǎng)動物。經(jīng)口每日劑量1 mg/kg*BW或更少即可致癌，如一次給以較大劑量即可于9～12月后誘發(fā)癌腫，同時發(fā)現(xiàn)有經(jīng)胎盤致癌的作用。亞硝胺是間接致癌物，亞硝酰胺是直接致癌物，終致癌物可能是碳鎓離子和偶氮烷烴［3-4］。N-亞硝基化合物在多種致突變試驗中出現(xiàn)陽性結(jié)果，還有致畸及胚胎毒性。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，N-亞硝基化合物的攝入與人類胃癌和食道癌的發(fā)生有關(guān)，但證據(jù)尚不充分。

3　來源

N-亞硝基化合物主要來源于動物性食物或蔬菜中的硝酸鹽和亞硝酸鹽。其中，蔬菜是硝酸鹽的主要來源，蘿卜、大白菜、芹菜、菠菜等蔬菜中含有較多的硝酸鹽［2］。亞硝酸鹽主要存在于腌菜、泡菜及添加硝的香腸、火腿中。仲胺、酰胺主要來自動物性食品，如肉、魚、蝦等的蛋白質(zhì)分解物，尤其當這些食品腐敗變質(zhì)時，仲胺等會大量增加［4-5］。這些前體進入人的胃中就可以合成N-硝基化合物。當患有慢性胃炎、萎縮性胃炎時，胃酸下降，胃內(nèi)細菌繁殖，細菌可促進N-硝基化合物的合成。這些化合物可能是慢性胃炎、萎縮性胃炎患者容易發(fā)生癌變的重要原因。此外，霉變食物由于霉菌的作用，可以促進N-硝基化合物的合成，在霉變食物中，含有較多的前體和亞硝基化合物。

4　檢測方法

食品中N-亞硝基化合物的含量一般為μg/kg水平，待測定的組分含量非常低，而其他的成分卻十分復(fù)雜，故在檢測時首先需要進行樣品的提取和凈化，以達到儀器檢測的要求。

4.1樣品的提取方法

N-亞硝基化合物的提取主要由其理化性質(zhì)所決定。由于在中性或弱堿性溶液中，N-亞硝基化合物的溶解度一般均比較小，而在醚類、醇類，特別是二氯甲烷等極性有機溶劑中的溶解度很大，因此通常使用極性有機溶劑從樣品中提取該類物質(zhì)。提取時加入中性或堿性的鹽類，如NaCl、K2CO3和Na2CO3，使其達到飽和狀態(tài)，利用鹽析效應(yīng)，提高萃取效率［6-7］。

測定揮發(fā)性亞硝胺時，由于其分子量比較小，且具有揮發(fā)性或水蒸汽揮發(fā)性，因此可以用直接蒸餾或者水蒸汽蒸餾方法進行提取、分離，這樣就可去除大部分非揮發(fā)性的雜質(zhì)，然后用上述方法進行萃取分離、純化，再進行干燥和濃縮，即可得到較為純凈的樣品提取濃縮液，用于檢測。

N-亞硝基化合物的分離方法常用有三種，即蒸餾法、消煮法和萃取法［6］。

4.1.1揮發(fā)性亞硝胺的提取——蒸餾法。包括水蒸汽蒸餾、真空蒸餾和直接蒸餾等方法，根據(jù)溶液的酸堿度又可以分為中性、酸性和堿性蒸餾。蒸餾分離的原理就是樣品在中性或堿性條件下蒸餾，使其前體物質(zhì)中不易形成新的N-亞硝基化合物，同時還可去除大部分酸性雜質(zhì)以及亞硝酸鹽；再進行酸性蒸餾，又可以去除胺類等堿性雜質(zhì)。魏法山等［6］測定如皋火腿中的揮發(fā)性N-亞硝胺時，將稱取好的200 g樣品經(jīng)高速搗碎后，加入120 g氯化鈉和100 mL超純水，高速攪拌2 min，然后進行蒸汽蒸餾，在接收瓶中倒入40 mL的二氯甲烷和少量冰塊，并置于冰水中，接收400 mL餾分，然后往餾分中加入80 g NaCl和4 g NaOH，攪拌均勻后再進行蒸汽蒸餾；這時接受餾分300 mL，接著加入40 g NaCl和6 g酒石酸，攪拌混勻后進行第三次蒸餾，最后接收250 mL的餾分，接著加入80 g NaCl溶解混勻，再轉(zhuǎn)移到500 mL的分液漏斗中，用160 mL的二氯甲烷分四次進行萃取，每次手動振搖5 min；將收集到的二氯甲烷萃取液，用無水Na2SO4干燥處理后，轉(zhuǎn)移到K-D濃縮器中，60℃條件下濃縮至10 mL左右，再用氮吹儀濃縮至1 mL，上機分析測定。

4.1.2固體狀亞硝胺的提取——消煮法。消煮法就是利用加熱使得N-亞硝基化合物充分溶解于極性溶劑中，然后過濾分離得到有機溶劑提取液，經(jīng)過干燥、濃縮后上機測定，主要適用于固體樣品。取200 g固體樣品，置于1 L的磨口燒瓶中，加入400 mL甲醇和30 g氫氧化鉀，攪拌均勻，裝上回流冷凝裝置，加熱蒸餾2 h后過濾，然后再用400 mL二氯甲烷再分液漏斗中分三次萃取。萃取液在50～55℃溫水浴蒸出二氯甲烷后，進行堿蒸餾，收集90 mL餾分，再進行酸蒸餾后，干燥濃縮［6-7］。

4.1.3萃取法。樣品經(jīng)提取濃縮后，還需進一步純化處理，以提高檢測的靈敏度。純化萃取的方法主要有柱色譜法和薄層色譜法。

4.1.3.1固相萃取柱。常用的固相萃取柱有硅膠柱、中性氧化鋁柱、酸性硅藻土柱以及酸性漂白土和硅膠柱等。一般將柱子用正戊烷活化、洗滌后，將稀釋后的樣品提取濃縮液加入固相萃取柱中，依次淋洗、洗脫，收集洗脫液在K-D濃縮器中濃縮至10 mL左右，待上機測定。

4.1.3.2薄層色譜法。一般采用硅膠G或者硅膠-CMC為吸附劑和粘合劑，分別經(jīng)正己烷、4：3：2（V/V）的正己烷-乙醚-二氯甲烷進行展開后，將薄層板晾干，用遮光板把中間部位全部掩蓋，僅在其兩側(cè)紫外光解并噴灑顯色劑Griss試劑或茚三酮溶液，使N-亞硝胺化合物顯現(xiàn)出其薄層色譜斑點，迅速用大頭針劃出各色斑對應(yīng)的薄層位置，用小刀把吸附劑從薄層板上分別刮下來，放入3號或4號玻璃砂芯漏斗內(nèi)，用100 mL二氯甲烷洗脫，然后洗脫液在K-D濃縮儀中濃縮。

4.1.3.3固相微萃取法（SPME）。Nrisinha等［8］用具丙烯酸酯硅纖維萃取頭測定了煙熏火腿中的N-亞硝基二丁胺和N-亞硝基二苯胺，證明固相微萃取用于測定肉制品中的亞硝胺類物質(zhì)是個無萃取溶劑、對環(huán)境無污染又能快速方便的進行測定的好方法；Ventanas等［9］在固體食物模型系統(tǒng)中評估了固相微萃取直接萃取裝置測定亞硝胺的方法。試驗結(jié)果表明，在室溫或4℃時，SPME是一種快速、適用的方法。

4.2儀器檢測方法

目前，食品中揮發(fā)性胺的檢測方法有熱能分析儀與氣相色譜儀或高效液相色譜儀聯(lián)用法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法、氣相色譜氮磷檢測器（GC-NPD）法。由于熱能分析儀和氮磷檢測器價格昂貴且專用性強，一般實驗室很難配備；于是利用配備檢測器的毛細管氣相色譜儀對測定冷卻豬肉中的N-亞硝基二乙胺含量的測定條件進行了優(yōu)化，得出了較滿意的測定結(jié)果。另外，還有測定N-亞硝基化合物的分光光度法。這些方法主要集中在對啤酒、醬油、香腸、冷卻豬肉等其中的揮發(fā)性亞硝胺的檢測或總亞硝基化合物的檢測。

4.2.1紫外和可見光光度法。紫外分光光度法可以直接測定N-亞硝基化合物的含量。N-亞硝胺特征的紫外光譜有兩個吸收峰，在340 nm有一個較弱的吸收峰，在230 nm處有一個較強的吸收峰。不過N-亞硝基化合物可以進行光反應(yīng)，在紫外照射時，N-亞硝胺光解并轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的腫胺和亞硝酸根，可以利用后者進行分光光度法測定，從而可間接測定出N-亞硝胺的量。如揮發(fā)性N-亞硝胺總量濃縮測定，首先腌菜、咸肉等樣品先以正丁醇萃取，同時加入NaOH使溶液保持堿性，放置過夜后，將濾液進行水蒸汽蒸餾，收集餾分，調(diào)節(jié)pH值為3～4，水蒸汽蒸餾并收集餾分，調(diào)節(jié)pH值至7～8，紫外光燈照15 min，然后通過強堿性離子交換樹脂，N-亞硝基化合物光解后的亞硝酸根濃縮吸附在離子交換樹脂上，用少量水洗，隨后用1 mol/L氯化鈉洗脫，洗脫液分管收集于1 mL的小試管中，然后根據(jù)在弱酸條件下亞硝酸根離子與氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，于波長550 nm處比色測定［7］。

4.2.2高效液相色譜法。高效液相色譜法檢測N-亞硝基化合物的報道較少，但其除了具有氣相色譜的高效、靈敏、選擇性強等優(yōu)點外，還可以測定非揮發(fā)性亞硝胺。高效液相色譜法檢測N-亞硝基化合物時，要把這類物質(zhì)通過化學反應(yīng)或光學反應(yīng)分解成胺類物質(zhì)和亞硝根離子，然后選擇不同的衍生化試劑進行衍生，再由不同的檢測器進行測定。這類物質(zhì)的分解有柱前分解和柱后分解，不同的分解時間采取不同的衍生化時間。Bell等［10］柱后光解N-亞硝胺后，用Griess試劑對亞硝根離子進行衍生化，紫外檢測器測定，發(fā)現(xiàn)對二烷基亞硝胺的檢測極限為8 pmol，且在0～200 g范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。對含有苯基的亞硝胺其檢測限為20 pmol；Cardenes等［11］首先使用氫溴酸-乙酸溶液使N-亞硝胺化學分解為胺類物質(zhì)和亞硝根離子，對相應(yīng)的胺類物質(zhì)進行丹璜酰氯化，然后過柱子，用熒光檢測器進行測定。此分析方法對N- 硝基嗎啉和N-硝基二乙胺的檢測限分別為8 pg和75 pg。

4.2.3氣相色譜法。王瑞等［12］建立了利用氣相色譜-FID檢測器測定熟肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物的方法。將稱取的肉樣經(jīng)蒸餾冷凝，再用二氯甲烷提取水相，合并提取液，再加入無水硫酸鈉脫水12 h后轉(zhuǎn)移至三角瓶中，于真空干燥箱中濃縮至2 mL，用二氯甲烷洗滌三角瓶后在該條件下濃縮至0.6 mL，用氣相色譜-FID檢測器檢測，N-亞硝基二乙胺在1～10 ug/mL范圍內(nèi)呈良好的線性（R=0.999），平均回收率為85%，檢出限位0.8 ug/mL。魏法山等［13］用帶有氮磷檢測器的氣相色譜（GC-NPD）測定了市售如皋火腿中的3種揮發(fā)性N-亞硝胺N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-二乙基亞硝胺（NDEA）和N-吡咯烷亞硝銨（NPYR），并用GC-MS進行了確證。檢測結(jié)果顯示，NPYR的含量最多，檢出率最高為100%，其次為NDEA，檢出率為95%，NDMA最小為85%。馮新昌等［14］建立了氣相色譜-熱能分析儀聯(lián)用技術(shù)測定啤酒、肉制品、醬油中揮發(fā)性亞硝胺的方法。結(jié)果顯示，在檢測的61份啤酒中有49份檢出了0.1～6.0 ug/kg的NDMA，在52份肉制品中有43份檢出了0.1～6.857 ug/kg的NDMA，在20份醬油中有16份檢出了0.1～6.7 ug/kg的NDMA。

4.2.4膠束電動毛細管色譜法（MEKC）。MEKC是近十年來迅速發(fā)展的一種分離分析方法，它結(jié)合了高效液相色譜和毛細管電泳的優(yōu)點，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、樣品用量少、自動化程度較高的特點，適合于分析處理復(fù)雜組分的樣品，在N-亞硝基化合物分析的應(yīng)用中也取得了良好的效果。近年來，固相萃?。⊿PE）技術(shù)已在色譜分析中得到廣泛應(yīng)用，使得MEKC法檢測靈敏度大大提高。Filho等［15］優(yōu)化了MEKC測定N-亞硝基化合物的方法，結(jié)合固相萃取技術(shù)測定了香腸中的N-亞硝胺；隨后Bell等利用N-亞硝胺光解后的產(chǎn)物，即相應(yīng)的胺類物質(zhì)和4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并雜惡二唑（NBD-Cl）發(fā)生衍生化反應(yīng)，然后MEKC分離，激光誘導(dǎo)熒光檢測器進行檢測，這個方法對N-亞硝基吡咯烷的檢測限為9×10-9。

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（責任編輯：朱迪國）

中圖分類號：TS205.2

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）01-0052-05

基金項目：國家畜禽質(zhì)量安全風險評估項目（GJFP2015007）轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)二甲基亞硝胺，過量食用可能會導(dǎo)致出現(xiàn)胃、腸、胰腺等癌變的風險。本文圍繞加工肉制品對人類健康安全的風險因素——亞硝酸鹽等N-亞硝基化合物，分別從N-亞硝基化合物的化學性質(zhì)、危害特征、來源及檢測方法等進行較為全面地綜述。

Hazard and Test Methods of N-nitroso Compounds

Zhao Sijun1，Li Xuelian2，Sun Xiaoliang1，Cao Xumin1，Wang Shuting1，Wang Xiaoyin1，Qu Zhina1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center/Livestock and Poultry Products Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of MOA，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Yebio Bioengineering Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract：In order to make people understand the risk factors affecting human health in the processed meat products，the chemical property，harmfulness characteristic，sources and detection methods of N-nitroso compounds were reviewed in this paper. N-nitroso compounds widely exist in bacon，smoked fish，tobacco，vegetables，beer，and other foods，it's a kind of strong chemical carcinogen. Due to the very low concentration of N-nitroso compounds in food，the sample extraction and purification must be carried out in the detection of samples. The main extracting methods include distillation，boiling and extraction. The ultraviolet spectra，high performance liquid chromatography，gas chromatography，micellar electrokinetic capillary chromatography were usually used as the detection instruments.

Key words：processed meat products；N-nitroso compounds；harmfulness；detection methods；review