勞秀杰，王靜靜，鄭東霞，邵春艷，何海建，王曉潔，王志亮，王曉杜，宋厚輝（.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 00；.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 660；.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江金華 007）

?

豬流行性腹瀉病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

勞秀杰1，王靜靜2，鄭東霞2，邵春艷1，何海建3，王曉潔1，王志亮2，王曉杜1，宋厚輝1
（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 311300；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江金華 321007）

摘 要：根據(jù)GenBank報(bào)道的N基因高度保守核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物。上下游引物與GenBank中登錄的153株豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N基因全長(zhǎng)序列匹配度分別是100%和97%。以本實(shí)驗(yàn)室分離流行毒株為模板，利用SYBR Green I熒光染料法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建重組質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，建立檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒核酸的方法。同一樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)＜0.9%。通過對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證，核酸檢測(cè)結(jié)果中的陽性樣品準(zhǔn)確率為100%。本研究所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床PEDV的檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；N基因；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR；檢測(cè)

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病，其特征為嘔吐、腹瀉、脫水［1］。本病主要發(fā)生在當(dāng)年12月至次年2月，夏季也可發(fā)生，可以感染各年齡階段的豬，其中哺乳仔豬最易感，發(fā)病率可達(dá)100%，平均死亡率可達(dá)50%。PED最早報(bào)道發(fā)生于英國(guó)和比利時(shí)，隨后在中國(guó)、加拿大、匈牙利、德國(guó)、日本及韓國(guó)等國(guó)家流行，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，編碼4個(gè)蛋白，分別為纖突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）。由于蛋白在PEDV病毒中數(shù)目最多，且高度保守，因此可以用此基因建立PEDV分子生物學(xué)診斷方法［3-7］。自2010年以來，PED在國(guó)內(nèi)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。為了能及時(shí)發(fā)現(xiàn)該病毒，避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失，本研究根據(jù)PEDV高度保守的N基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性熒光定量PCR引物并建立了一種可快速、靈敏、特異地檢測(cè)PEDV的熒光定量PCR方法。

1　材料與方法

1.1生物材料

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

2×SYBR.premix、ExTaq GC、Rox reference Dye II、DNA Maker DL2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自生工公司；Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；零背景快速連接試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄的PEDV的N基因核苷酸序列分別在（723-1286 bp）和（1001-1180 bp），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了常規(guī)PCR引物和熒光定量PCR引物。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1和表2。

表1　常規(guī)PCR引物

表2　熒光定量PCR引物

1.4熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立

1.4.1病毒RNA提取。收集感染了72 h PEDV的Vero細(xì)胞沉淀，加入Trizol試劑中，振蕩混勻；然后4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至空的1.5 mL離心管。加入200 μL氯仿，振蕩15 s，室溫靜置3 min，4℃，1 2000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至空的1.5 mL離心管。加入等體積的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min ；4℃，1 2000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至空的1.5 mL離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后，室溫靜置10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入用DEPC水配制的70 %乙醇洗滌沉淀1次，4℃，12000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥后溶于適量的RNase free水中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2cDNA 反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA置-20℃保存。

1.4.3常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：25 mmol/ L MgSO42μL，10× buffer 2.5μL，2 mmol/L dNTP 2.5μL，KOD plus 酶1μL，PEDV cDNA 2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 14μL。反應(yīng)條件為：94℃3 min，1個(gè)循環(huán)；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)模板的制備。按照膠回收試劑盒說明書割膠回收1.4.3擴(kuò)增的目的片段，并將其與零背景載體連接，隨后轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Escherichia coli 感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖菌提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后測(cè)定OD260值，將其濃度換算成拷貝/μL，放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 熒光定量PCR擴(kuò)增。已優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL，其中2×SYBR Green I premix 10 μL，輔助染料0.4 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板1μL，ddH2O 7.8μL。采用三步法擴(kuò)增反應(yīng)條件：第一步95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；第三步95℃ 1 min，60℃ 30 s，95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。

1.4.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線的建立。以10倍梯度稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板，模板濃度為1×109～1×100copy/μL，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并設(shè)置陰性對(duì)照。利用熒光定量PCR儀隨機(jī)附帶的軟件分析標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.4.7靈敏度試驗(yàn)。以10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)模板，模板濃度為1×109～1×100copy/μL，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算出熒光定量PCR檢測(cè)模板的最低拷貝數(shù)，設(shè)置陰性對(duì)照。

1.4.8重復(fù)性試驗(yàn)。對(duì)同一陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒設(shè)三個(gè)重復(fù)管，用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)其重復(fù)性，計(jì)算其組內(nèi)變異系數(shù)。

1.4.9特異性試驗(yàn)。用PEDV熒光定量PCR檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型基因組，確定該方法的特異性。

1.4.10臨床樣品檢測(cè)。將采集的多個(gè)豬場(chǎng)病豬的肛門棉試子進(jìn)行處理，提取RNA，用建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用特異性引物對(duì)PEDV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得目的片段564 bp且無非特異性條帶（圖1），將陽性質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，同源性達(dá)99%。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線的建立

用10倍梯度稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，模板濃度分別為1×109～1×100copy/μL，用熒光定量PCR儀附帶的軟件分析即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）和溶解曲線（圖3）。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=1.000，斜率為-3.200，截距為36.58， Eff=105.4%。溶解曲線峰型銳利，熔解溫度一致Tm值為81.7℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物等其它峰值出現(xiàn)。

圖1　PEDV N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2　熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線

2.3靈敏度試驗(yàn)

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板稀釋10個(gè)不同濃度，分別是 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copy/μL，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示檢測(cè)有效值至1×100copy/ μL（圖4），比常規(guī)PCR （1×102copy/μL）的靈敏度高100倍（圖5）。

圖4　熒光定量PCR靈敏度分析

圖5　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.4特異性試驗(yàn)

分別以TGEV、PRRSV、CSFV和PCV2的核酸作為模板，用PEDV熒光定量PCR檢測(cè)，并設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果顯示只有PEDV陽性模板產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖6），表明設(shè)計(jì)的熒光定量PCR檢測(cè)引物有良好的特異性。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

圖6　熒光定量PCR的特異性分析

選取1×106，1×105，1×104copy/μL的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)模板做三個(gè)重復(fù)進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)低于0.9%（表3）；組間重復(fù)性試驗(yàn)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)低于0.9%（表4），表明PEDV熒光定量PCR檢測(cè)方法有較好的重復(fù)性。

表3　熒光定量PCR組內(nèi)重復(fù)性分析

表4　熒光定量PCR組間重復(fù)性分析

2.6臨床樣品檢測(cè)

采取3個(gè)不同豬場(chǎng)疑似PEDV感染的病豬肛門拭子共計(jì)18份，收集細(xì)胞毒提取核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示14份樣品呈現(xiàn)陽性，擴(kuò)增曲線、溶解曲線見圖7、圖8。擴(kuò)增所獲得的序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明所獲得序列全部為PEDV病毒核酸序列。陽性樣品準(zhǔn)確率為100%，表明該樣品存在PEDV核酸。

3　討論

圖7　熒光定量PCR檢測(cè)臨床樣品擴(kuò)增曲線

由于PEDV與TGEV在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化等方面很難區(qū)分，所以建立快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法尤為重要［8-9］。目前檢測(cè)PEDV的方法有，PCR技術(shù)［10-11］、以RT為基礎(chǔ)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)［12］、ELISA實(shí)驗(yàn)［13］、膠體金免疫層析實(shí)驗(yàn)［14］、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）實(shí)驗(yàn)［5］等。PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，較其他幾種檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入SYBR Green I 熒光物質(zhì)對(duì)核酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)，與常規(guī)PCR比較，具有重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、工作效率高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，并可避免由擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染所導(dǎo)致的假陽性，同時(shí)適用于高度變異的基因檢測(cè)。

圖8　熒光定量PCR檢測(cè)臨床樣品溶解曲線

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)優(yōu)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因此被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）認(rèn)可并推薦應(yīng)用于畜禽疾病的檢測(cè)。然而熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果受很多因素的影響，如：樣品的來源及處理、提取核酸的方式方法、核酸的質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)操作技能、實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境、PCR儀器的選擇、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等。其中，最重要的影響因素是引物的設(shè)計(jì)。因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí)要考慮到GC含量、退火溫度、長(zhǎng)度、保守性以及與流行毒株的匹配度等方面的問題，在引物設(shè)計(jì)過程中考慮到的問題越全面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越準(zhǔn)確、可靠。

本研究根據(jù)PEDV N基因設(shè)計(jì)一對(duì)可擴(kuò)增出564 bp目的片段的引物，構(gòu)建陽性對(duì)照，同時(shí)用另外一對(duì)擴(kuò)增180bp的引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為1.0，擴(kuò)增效率為105.4%。溶解曲線峰型銳利，熔解溫度一致，Tm值為81.7℃，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。靈敏度高，最低檢出線為1×100copy/μL ；特異性強(qiáng)，與其它豬病病毒無交叉反應(yīng)；耗時(shí)短，整個(gè)過程只需105 min，且批內(nèi)批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)低于0.9%。以上結(jié)果表明建立的SYBR GreeenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法特異、敏感、快速、重復(fù)性好，不僅可以快速準(zhǔn)確診斷PEDV，還可用于PEDV流行病學(xué)調(diào)查、疫苗效價(jià)評(píng)估和致病機(jī)理等方面的研究，適合臨床推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

［1］郎景華.黑龍江省部分地區(qū)PED流行特征及病毒生物學(xué)特性研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［2］Pensaert M B，de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine［J］. Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

［3］Hou X L，Yu L Y，Liu J. Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea （PEDV）antibodies［J］. Vet Microbiol，2007，123（1-3）：86-92.

［4］李思銀，楊亮宇，楊玉艾. 豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷方法［J］. 豬業(yè)科學(xué)，2010（12）：54-57.

［5］Song D S，Yang J S，Oh J S，et al. Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean fi eld strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3［J］. Vaccine，2003，21（17-18）：1833-1842.

［6］Brian D A，Baric R S. Coronavirus genome structure and replication［J］. Curr Top Microbiol Immunol，2005，287：1-30.

［7］Wang K，Lu W，Chen J，et al. PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production［J］. FEBS Lett，2012，586（4）：384-391.

［8］邱永敏，朱瑞良，崔國(guó)林. 豬流行性腹瀉防控措施與體會(huì)［J］. 山東畜牧獸醫(yī)，2013，34（6）：46-47.

［9］尹寶英，吳旭錦，熊忙利.豬流行性腹瀉診斷方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：156-159.

［10］Ishikawa K，Sekiguchi H，Ogino T，et al. Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR［J］. J Virol Methods，1997，69（1-2）：191-195.

［11］Kubota S，Sasaki O，Amimoto K，et al. Detection of porcine epidemic diarrhea virus using polymerase chain reaction and comparison of the nucleocapsid protein genes among strains of the virus［J］. J Vet Med Sci，1999，61（7）：827-830.

［12］Ren X，Li P. Development of reverse transcription loopmediated isothermal amplifi cation for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus［J］. Virus Genes，2011，42（2）：229-235.

［13］Knuchel M，Ackermann M，Muller H K，et al. An ELISA for detection of antibodies against porcine epidemic diarrhoea virus （PEDV） based on the specifi c solubility of the viral surface glycoprotein［J］. Vet Microbiol，1992，32（2）：117-134.

［14］張利勃，周鐵忠，王坤，等.豬流行性腹瀉膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)的建立及其應(yīng)用［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（3）：374-377.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）01-0062-05

基金項(xiàng)目：浙江省科技廳項(xiàng)目（2014C32061，2014C02003）；金華市農(nóng)業(yè)類重點(diǎn)研究項(xiàng)目（2014-2-003）

通訊作者：宋厚輝，王曉杜

Development of Real-time Quantitative RT-PCR Method for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Lao Xiujie1，Wang Jingjing2，Zheng Dongxia2，Shao Chunyan1，He Haijian3，Wang Xiaojie1，Wang Zhiliang2，Wang Xiaodu1，Song Houhui1
（1.College of Animal Science and Technology，Zhejiang A&F University，Hangzhou，Zhejiang 311300；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. School of Agricultural and Biological Engineering，JinHua Polytechnic，Jinhua，Zhejiang 321007）

Abstract：A pair of primers was synthesized according to the conservative sequence of PEDV N genes that have been retrieved from GenBank. The forward and reverse primers were aligned with 153 full-length sequences of PEDV N genes，and exhibited identifi es of 100% and 97%，respectively. The fl uorescent dye SYBR Green I was used to develop the real-time RT-PCR method. The N gene of an isolated PEDV was amplifi ed by RT-PCR，subcloned into a plasmid，and then was used as a positive control. The coeffi cient of variation was less than 0.9% in triplicate assays. Based on positive clinical samples，100% agreement was achieved by using this real-time RT-PCR method. This method would be useful in diagnostic analysis against PEDV in epidemiological investigations.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus；N gene；real-time fl uorescent quantitative RT-PCR；test