李建臻，楊 苗，徐 剛（.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 630；.四川出入境檢驗檢疫局，四川成都 630）

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高致病性豬藍(lán)耳病自然病例血清致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的測定與分析

李建臻1，楊 苗2，徐 剛1
（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 611130；2.四川出入境檢驗檢疫局，四川成都 611130）

摘 要：本試驗旨在探究高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRS）自然病例中致炎因子IL-1、IL-6和TNF-α含量，進(jìn)而闡述HP-PRRS的致病機(jī)理，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的HP-PRRS防控提供理論基礎(chǔ)。在成都地區(qū)4個發(fā)病豬場采集具有臨床癥狀的豬血清（含5頭瀕死豬）35份與無臨床癥狀豬血清23份，利用RT-PCR分別檢測出HP-PRRSV陽性血清25份和11份。將檢測出陽性表現(xiàn)癥狀的25份血清、檢測陽性無臨床癥狀的11份血清及檢測陰性的12份血清分成3組，分別標(biāo)注為病豬組、隱性感染組和健康對照組，運用ELISA方法進(jìn)行IL-1、IL-6和TNF-α含量測定。結(jié)果顯示，IL-1含量在三組中差異極顯著（P＜0.01），病豬組極顯著高于隱性感染組與健康組（P＜0.01），隱性感染組與健康對照組差異不顯著（P＞0.05）；IL-6含量在三組中差異顯著（P＜0.05），病豬組顯著高于隱性感染組與健康對照組（P＜0.05），隱性感染組與健康對照組差異不顯著（P＞0.05）；TNF-α含量在三組之間無顯著差異（P＞0.05）。該結(jié)果表明IL-1與IL-6在HP-PRRS感染致病中具有重要作用。

關(guān)鍵詞：高致病性藍(lán)耳病；自然病例；IL-1；IL-6；TNF-α

藍(lán)耳病是豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的俗稱。1996年郭寶清等首次從國內(nèi)發(fā)病豬群中分離出豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）。2006年我國很多地區(qū)暴發(fā)了“無名高熱”病，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所分離和鑒定，證實其病原主要是高致病性藍(lán)耳病變異株（HP-PRRSV）。HP-PRRSV的出現(xiàn)給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了非常大的損失，已成為當(dāng)今豬場危害最大的病原之一［1-3］。已有資料表明，PRRSV所造成的病理學(xué)特點主要是彌漫性肺泡損害，表現(xiàn)為以肺泡和肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞明顯增多為主的肺部病變、免疫器官損傷、全身性血管炎與繼發(fā)感染等。急性呼吸窘迫綜合征（acuterespiratory distress syndrome，ARDS）是導(dǎo)致病豬死亡的主要原因，其中致炎因子是很重要的因素。IL-1、IL-6 與TNF-α等致炎細(xì)胞因子，在感染條件下，如果過量表達(dá)，就會引起生物體某些組織器官的損傷［4］。為探索豬血清中IL-1、IL-6與TNF-α含量與自然感染PRRSV的關(guān)系，在成都地區(qū)的4個自然發(fā)病豬場開展了豬血清中致炎因子含量測定試驗，期望為PRRSV致病機(jī)制研究提供理論材料，以幫助尋求有效控制炎癥反應(yīng)、減輕PRRS臨床危害的方法。

1　試驗材料

1.1試驗樣本

本研究所用實驗樣本來自2014年3月至2015 年3月的4個豬場，共58份，其中有明顯臨床癥狀的35份，無明顯臨床癥狀的23份。

1.2試劑與藥品

Pig-TNF-α檢測試劑盒（批號：15-01）、Pig-IL-1檢測試劑盒（批號：15-02）、Pig-IL-6檢測試劑盒（批號：15-01）均購自成都丹鳳生物科技有限公司；TRIZOL購自上海生工；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV））Ver. 3.0購自大連寶生物公司。

1.3引物

診斷高致病性藍(lán)耳病與低致病性藍(lán)耳病RTPCR引物：參考涂長春教授惠贈設(shè)計（擴(kuò)增片段高致病性藍(lán)耳病180 bp；低致病性藍(lán)耳病270 bp）。

1.4主要儀器

DKB-501 A型 凝 膠 成 像 系 統(tǒng)（Alpha Innotech）；DNP-9163型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；C1000普通梯度PCR儀器（Bio-Rad）；微量移液器（德國Eppendorf）；MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)（Milliproe）；680型酶標(biāo)儀（BIORAD）。

2　試驗方法

2.1RNA的提取與PRRSV抗原檢測。

RT-PCR反應(yīng)體系及條件參照西南大學(xué)榮昌校區(qū)生物技術(shù)中心實驗室介紹方法［5］。反應(yīng)結(jié)束后取5 uL PCR 產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

2.2IL-1、IL-6和TNF-α含量測定

選取HP-PRRSV抗原檢測陽性的血清25份、隱性感染HP-PRRSV（無臨床癥狀，但RT-PCR檢測陽性）的血清11份和健康豬血清12份，運用ELISA方法進(jìn)行IL-1、IL-6和TNF-α含量測定。檢測方法按照試劑盒說明進(jìn)行，在450 nm波長測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各細(xì)胞因子含量。

2.3試驗數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 16.0軟件對IL-1、IL-6和TNF-α含量測定數(shù)據(jù)運用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行方差分析。

3　結(jié)果

3.1病原檢測結(jié)果

高致病性藍(lán)耳病病原檢測結(jié)果見表1，樣品PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳圖見圖1。

由表1和圖1并結(jié)合臨床癥狀與病例解剖結(jié)果可知，4個養(yǎng)豬場均暴發(fā)了高致病性藍(lán)耳病疫情，病毒感染陽性率均超過50%，并存在隱性感染、不表現(xiàn)臨床癥狀的豬。

圖1　部分HP-PRRSV RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳圖

3.2IL-1、IL-6與TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照TNF-α ELISA試劑盒說明書操作，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為640 pg/mL，倍比稀釋后，測定A450OD值（表2），繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。計算TNF-α濃度與A450OD值，相關(guān)公式為：y=817.4x-14.20；計算IL-1濃度與A450OD值，相關(guān)公式為：y=729.3x-52.76；計算IL-6濃度與A450OD值，相關(guān)公式為：y=827.5x-21.33。

表2　ELISA檢測豬TNF-α標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)果

圖2　TNF-α濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3IL-1、IL-6與TNF-α檢測結(jié)果

將臨床發(fā)病組、隱性感染組、健康組的血清分別使用檢測試劑盒測出OD值帶入分別標(biāo)準(zhǔn)公式測得每組平均數(shù)值（表3）。

表3　IL-1、IL-6與TNF-α檢測含量結(jié)果統(tǒng)計（pg/ml）

發(fā)病組、隱性感染組、健康組的IL-1含量差異極顯著（P＜0.01），多重比較顯示發(fā)病組極顯著高于健康組與隱性感染組（P＜0.01），而健康組與隱性感染組之間差異不顯著（P＞0.05）；發(fā)病組、隱性感染組、健康組IL-6含量差異顯著（P＜0.05），多重比較顯示，發(fā)病組顯著高于健康組與隱性感染組（P＜0.05），而發(fā)病組與隱性感染組之間差異不顯著（P＞0.05）；TNF-α含量檢測三組差異不顯著（P＞0.05），數(shù)值顯示健康組略高于發(fā)病組與隱性感染組。

4　分析與討論

4.1病原檢測結(jié)果的分析與討論

高致病性藍(lán)耳病是目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的傳染病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗選擇的4個自然發(fā)病豬場的HPPRRSV感染率均在50%以上，表明該地區(qū)主要流行變異PRRSV，但在疑似陽性血清中的檢出率低于80%，說明PRRSV感染后的臨床癥狀、病理變化復(fù)雜多變。

4.2IL-1、IL-6與TNF-α檢測結(jié)果的分析與討論

據(jù)文獻(xiàn)報道，促炎性細(xì)胞因子具有兩面性：正常條件下可以促使白細(xì)胞數(shù)量增加、誘發(fā)免疫反應(yīng)以及減少病毒復(fù)制，但在某些感染條件下的過量表達(dá)，會引起生物體某些組織器官的損傷［6］（血管滲透性增加，導(dǎo)致肺水腫和支氣管收縮）。研究顯示感染豬體內(nèi)的細(xì)胞因子（包括γ-IFN、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α）含量均升高［7-13］?！敦i病學(xué)》第九版指出，PRRSV感染后，致炎因子（IL-1、IL-6、TNF-α）能促進(jìn)白細(xì)胞聚集和活化，增加毛細(xì)血管的滲透性（肺水腫）并誘導(dǎo)發(fā)熱、厭食和精神沉郁等系統(tǒng)反應(yīng)，引起支氣管高反應(yīng)性和收縮等哮喘樣癥狀［14］。

本實驗運用ELISA方法直接檢測豬體外周血清中炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6與TNF-α含量，與以上學(xué)者研究方法不同，該方法更能反應(yīng)三種炎性細(xì)胞因子在豬體內(nèi)的真實水平。試驗表明，表現(xiàn)臨床癥狀的病豬血清中IL-1與IL-6含量明顯高于隱性感染豬與健康豬，這是因為PRRS病例在病毒侵染協(xié)助下，豬體內(nèi)IL-1與IL-6表達(dá)增高。試驗中隱性感染組血清IL-1與IL-6含量與健康豬血清含量差異不顯著，試驗者認(rèn)為隱性感染豬可能處于感染早期，并未達(dá)到最高水平，因此未引起致炎因子升高，從而未能表現(xiàn)出臨床癥狀。

TNF-α含量在本次試驗中差異不顯著，分析原因可能是：研究方法不同，本試驗直接檢測血清中TNF-α含量；檢測時間不同，本試驗采集樣本全部為自然發(fā)病病例，HP-PRRS感染具體時間難以確定，而TNF-α在體內(nèi)含量隨時間而變化［15］..

5　結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)豬感染HP-PRRSV后，其體內(nèi)的IL-1與IL-6含量會顯著增高，提示其過量表達(dá)在造成肺部病變、免疫器官損傷、全身性血管炎和繼發(fā)感染中扮演重要角色。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

中圖分類號：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）01-0067-04

通訊作者：楊 苗

Detection and Analysis of IL-1、IL-6 and TNF-α in Sera of Natural HP-PRRS Infected Pigs

Li Jianzhen1，Yang Miao2，Xu Gang1
（1. Chengdu Agricultural Science and Technology Vocational College，Chengdu，Sichuan 611130；2. Sichuan Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract：To fi nd the relationship among IL-1、IL-6、TNF-α content in blood sera of HP-PRRSV infected pigs，so to explain the pathogenesis of HP-PRRS，and to provide a theoretical basis for the prevention and control of HP-PRRS，48 blood sera samples from 4 farms in Chengdu were sampled and tested by ELISA，including 25 RT-PCR positive samples with clinical symptoms and 11 positive samples without clinical symptoms and 12 negative samples. The results showed that the difference of IL-1 in positive pigs was signifi cant（P＜0.01） compared with the other two groups，and the differences of IL-1 between the other two groups were not signifi cant （P＞0.01） . The differences of IL-6 levels among the three groups were signifi cant（P＜0.05），and IL-6 in positive samples with clinical symptoms were higher（P＜0.05）than the other two groups. The differences of of IL-6 in the other two groups with negative results were not signifi cant（P ＞0.05）. The differences of TNF-α among the three groups were not signifi cant（P＞0.05）. These results showed that IL-1and IL-6 increased in blood serum when pigs were infected by HP-PRRSV and played important role in infection，while TNF-α has little change.

Key words：HP-PRRS；natural infection；IL-1；IL-6；TNF-α