宋新宇，劉兆霞，竇小龍，郭莉莉，馬 爽，范根成（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

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2012
—2014年我國雞傳染性支氣管炎分子流行病學(xué)調(diào)查

宋新宇，劉兆霞，竇小龍，郭莉莉，馬 爽，范根成
（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114）

摘 要：為了解近年來我國雞傳染性支氣管炎病毒的主要類型，2012—2014年，從華東、華北和華中等地區(qū)出現(xiàn)傳染性支氣管炎（IB）的養(yǎng)雞場(chǎng)中，采集病料進(jìn)行病毒分離。從中分離鑒定出IBV流行株69株。對(duì)所有分離株進(jìn)行S1基因擴(kuò)增、測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示毒株共包含6個(gè)基因型，根據(jù)各基因型中包含的毒株數(shù)量多少依次為：QX型（54株，占78.26%）、Mass型（6株，占8.7%）、4/91型（3株，占4.35%）、TW-I型（2株，占2.90%）、tl/CH/LDT3/03型（2株，占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株，占2.90%）。將GenBank中收錄的所有2012—2014年間國內(nèi)分離株S1基因序列下載并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果表明QX型IBV已成為當(dāng)前國內(nèi)流行的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型。

關(guān)鍵詞：流行病學(xué)調(diào)查；雞傳染性支氣管炎病毒；同源性比對(duì)；一致；QX型

雞傳染性支氣管炎（IB）是由冠狀病毒科的雞傳染性支氣管病毒（IBV）引起的雞的一種傳染病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及剖檢病變不同，可分為呼吸型、生殖型、腎型等多種類型，死亡率為10%～50%。此病不僅可以導(dǎo)致育雛及育成期的雞發(fā)病，而且也可導(dǎo)致產(chǎn)蛋期的雞不同程度地發(fā)病。從病死雞的腺胃、氣管和腎臟中可分離到IBV。

IBV在自然界更換宿主的過程中不斷發(fā)生變異。20世紀(jì)30到40年代，IBV主要侵害呼吸和生殖器官，60年代陸續(xù)有腎型的發(fā)生與流行，90年代嗜胃腸道毒株開始出現(xiàn)并給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失［1］。

近年來，由于IB疫苗大量使用所帶來的免疫壓力，國內(nèi)流行的IBV毒株處于持續(xù)不斷地進(jìn)化當(dāng)中。近幾年主要使用的Mass型、LDT3-A型和4/91型等疫苗，對(duì)當(dāng)前流行株的交叉保護(hù)效果并不理想。鑒于目前免疫壓力的存在，故開展此次調(diào)查，并從分子生物學(xué)方面進(jìn)行研究分析。

1　材料

1.1SPF種蛋

購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2病料

從華東、華北、華中、華南、西北和東北等地區(qū)出現(xiàn)IB病變的養(yǎng)雞場(chǎng)（戶），采集?。ㄋ溃╇u腺胃、氣管和腎臟。

1.3引物

參照GenBank收錄的IBV S1基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)，由上海invitrogen公司合成。如下所示：

上游引物IBV-87：5'-TAT TGA TTA GAG ATG TTG GG-3'；

下游引物S1 Oligo3'：5'-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3'。

1.4酶類和主要試劑

反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）購自大連寶生物工程有限公司；Phusion?超保真DNA聚合酶購自美國New England Biolabs公司；RNA提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

2　流行病學(xué)調(diào)查及方法

2.1流行病學(xué)調(diào)查

2012—2014年，從華東、華北、華中、華南、西北和東北等地區(qū)出現(xiàn)傳IB病變的養(yǎng)雞場(chǎng)（戶），采集?。ㄋ溃╇u腺胃、氣管和腎臟。發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁，羽毛蓬松，兩翅下垂，排白色或水樣稀便，有不同程度的呼吸道癥狀，漸進(jìn)性消瘦。剖檢病死雞可見氣管有不同程度的出血，氣管內(nèi)黏液增多；腎臟明顯腫脹，有大量尿酸鹽沉積（呈花斑腎）；部分雞輸尿管擴(kuò)張，充滿白色尿酸鹽；直腸后段及泄殖腔可見較多尿酸鹽沉積；個(gè)別雞腺胃腫脹。病死雞嚴(yán)重脫水，消瘦，皮下肌肉干燥。這些發(fā)病雞場(chǎng)均免疫了IB疫苗。

2.2病毒分離與鑒定

將無菌采集的樣品用滅菌生理鹽水勻漿制成20%懸液，3 000 r/min離心15 min，取上清除菌后，經(jīng)尿囊腔分別接種10日齡SPF雞胚，孵化144 h，收集尿囊液并進(jìn)行HA測(cè)定，同時(shí)觀察雞胚的變化。一般每份樣品需要連續(xù)盲傳3～5代，對(duì)出現(xiàn)IB典型病變的雞胚，收獲尿囊液進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.3分子生物學(xué)鑒定

取采集到的疑似IB病料，根據(jù)GenBank中收錄的IBV S1基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行S1基因的RT-PCR擴(kuò)增，序列測(cè)定。

2.4序列比較分析

用MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比較和分析。

3　結(jié)果

3.1流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

3.1.1基本情況。 2012—2014年，先后在華東、華北、華中、華南、西北和東北等地區(qū)調(diào)查了106個(gè)發(fā)病雞場(chǎng)。通過對(duì)發(fā)病雞場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查、采集病料進(jìn)行病毒分離和鑒定及相關(guān)研究，共分離到69株IBV。毒株分離時(shí)間及數(shù)量地域分布情況見表1。

表1　IBV毒株分離時(shí)間及數(shù)量地域分布

3.1.2發(fā)病特點(diǎn)

3.1.2.1易感動(dòng)物。肉用型雞在3～5周齡最易發(fā)病。蛋用型雞在育雛期35周齡和產(chǎn)蛋期的25～30周齡較易發(fā)病。肉用型雞比蛋用型雞易感，在肉用型雞中，白羽肉雞的IBV檢出率占70%，其他品種占12%，說明白羽肉雞比我國地方品種易感。

3.1.2.2發(fā)病情況。肉用型雞IB發(fā)病率高達(dá)82%，蛋用型發(fā)病率為18%。蛋雞/黃/麻雞的死亡率為3%～15%，白羽肉雞死亡率可達(dá)到30%。

3.1.2.3傳播途徑。主要通過空氣和病雞的糞便、排泄物傳播。雛雞（被IBV污染的雞）運(yùn)輸是本病暴發(fā)和流行的一個(gè)重要傳播途徑。

3.1.2.4臨床癥狀與剖檢病理變化。發(fā)病早期，雞群先出現(xiàn)精神不振，嚴(yán)重時(shí)沉郁，羽毛松亂，伴有呼吸道癥狀，喘氣、呼嚕、咳嗽，腫眼流淚，嚴(yán)重的單側(cè)或雙側(cè)失明，中期出現(xiàn)拉黃綠色、黃白色稀便，采食減少，飲水可能增多，雞逐漸消瘦，生長緩慢或停止，最后衰竭死亡。剖檢病變主要表現(xiàn)為氣管環(huán)黏膜充血、出血，表面有漿液性或干酪性分泌物，部分病死雞可見腺胃輕度腫脹、粘膜扁平、乳頭不清 ；大部分病死雞剖檢可見明顯的腎臟腫大、花斑腎。

3.2病原的分離及鑒定

從華東、華北、華中、華南、西北和東北地區(qū)發(fā)病雞群中無菌采集氣管、腎臟和腺胃，制備20%的乳懸液，接種10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2 mL，37℃孵化144 h，收集尿囊液并進(jìn)行HA測(cè)定，同時(shí)觀察雞胚的變化。連續(xù)盲傳3～5代，各代尿囊液HA效價(jià)呈陰性，接種后部分雞胚出現(xiàn)早期死亡。死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚發(fā)育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化。

3.3分子生物學(xué)鑒定

各流行株的S1基因擴(kuò)增情況比較穩(wěn)定。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察，可見一條清晰的1.7 kb左右大小的條帶，與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果相符。各毒株序列測(cè)定結(jié)果分析表明，所得序列均為IBV S1基因，被擴(kuò)增出的片段中均含有編碼S1蛋白的完整閱讀框架。

3.4IBV同源性比對(duì)分析

圖1　2012—2014年IBV分離株及部分經(jīng)典疫苗株S1基因遺傳進(jìn)化樹

3.4.1各地分離株與部分IBV經(jīng)典疫苗株的序列比較分析。對(duì)2012—2014年間分離的IBV流行毒株69株，用MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比較和分析，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示毒株共包含6個(gè)基因型，根據(jù)各基因型中包含的毒株數(shù)量多少依次為：QX型（54株，占78.26%）、Mass型（6株，占8.7%）、4/91型（3株，占4.35%）、tl/CH/LDT3/03型（2株，占2.90%）、TW-I型（2株，占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株，占2.90%）。遺傳進(jìn)化樹見圖1。

3.4.2GenBank收錄國內(nèi)IBV分離株S1基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果。共從GenBank中下載獲得2012—2014年間國內(nèi)IBV流行毒株S1基因序列437條，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示其共包含10個(gè)基因型，根據(jù)各基因型中包含的毒株數(shù)量多少依次為：QX型（328株，占75.06%）、Mass型（22株，占5.03%）、CK/CH/LSC/99I型（19株，占4.35%）、HN-08型（18株，占4.12%）、4/91型（17株，占3.89%）、TW-I型（12株，占2.75%）、CH-VI型（8株，占1.83%）、tl/CH/LDT3/03型（7株，占1.60%）和TW-II型（5株，占1.14%），另外還有不能歸入任何已知范疇的基因型（1株，占0.23%）。結(jié)果見圖2。

圖2　2012—2014年GenBank收錄IBV國內(nèi)分離株S1基因遺傳進(jìn)化樹

4　討論

自1930年首次在美國北達(dá)科他州發(fā)現(xiàn)IB以來，幾乎所有養(yǎng)雞國家均發(fā)現(xiàn)有該病流行。我國于1978年由鄺榮祿首次報(bào)道在廣東分離到IBV［2］。流行的IBV血清型/基因型呈典型的地域性分布。近年來隨著交通運(yùn)輸?shù)娜找姘l(fā)達(dá)和動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品國際貿(mào)易的日益頻繁，部分基因型IBV毒株開始出現(xiàn)跨國家和地區(qū)傳播與流行的態(tài)勢(shì)［3］。

目前，疫苗免疫仍是控制IB最常用、最有效的措施，最常用的是Mass型疫苗。該型疫苗也是目前在世界范圍內(nèi)使用最廣泛的疫苗，常用的毒株H120、H52、Ma5、W93、28/86和M41在基因型上均屬于Mass型，其中H120和H52在很多國家均有應(yīng)用，被認(rèn)為對(duì)多種血清型的毒株均能提供交叉免疫保護(hù)。但在出現(xiàn)新IBV基因型毒株流行的情況下，需要及時(shí)研制與該基因型一致的新型疫苗并在生產(chǎn)中與常規(guī)疫苗配合使用，才能取得較好的免疫保護(hù)效果。在美國，Mass型、Conn型和Ark型的疫苗使用范圍最廣，而其他型（如DE072）只是地區(qū)性使用［3］。在一些歐洲國家，除了H120株外，還接種D274、D1466和4/91（793/B）等疫苗株。在澳大利亞，則使用他們自己的B亞型和C亞型IBV疫苗。在韓國，除了H120株外，還接種K2株（KM91型）［3］。目前在我國應(yīng)用的疫苗，除H120株和H52株以外，還有W93、28/86、Ma5等毒株，均屬于Mass型［4］；2011年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了一個(gè)新的活疫苗LDT3-A株，屬于LDT3-A型；雖然有報(bào)道認(rèn)為4/91疫苗對(duì)流行毒株保護(hù)效果優(yōu)于傳統(tǒng)的Mass型疫苗，但目前該疫苗在國內(nèi)未獲得官方批準(zhǔn)。

大量的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，由于IB疫苗大量使用所帶來的免疫壓力，在國內(nèi)流行的IBV毒株正處于持續(xù)不斷地進(jìn)化當(dāng)中。QX型（也稱LX4型）為最主要的基因型（54.1%）［5］。根據(jù)最近的研究報(bào)道，在2009年以后的國內(nèi)分離株中，QX型毒株所占的比重至少在65%以上［6-14］。根據(jù)本研究對(duì)2012—2014年期間國內(nèi)IBV的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，QX型毒株已經(jīng)成為國內(nèi)主要流行基因型，并且仍有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有疫苗對(duì)QX型毒株交叉免疫保護(hù)性較低［15］，因此研制對(duì)QX型交叉保護(hù)性好的疫苗日益迫切。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）01-0013-05

通訊作者：范根成

Epidemiological Survey on Avian Infectious Bronchitis in China from 2012 to 2014

Song Xinyu，Liu Zhaoxia，Dou Xiaolong，Guo Lili，Ma Shuang，F(xiàn)an Gencheng
（Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract：In order to investigate the epidemiology of the avian infectious bronchitis （IB）strains in China，the infected samples of sick/dead chickens in suspected IB farms were collected from various provinces in the east，north and central area of China from 2012 to 2014. By virus isolation test，69 IB isolates were identifi ed. The S1 gene of all isolates were sequenced and conducted by the phylogenetic analysis.The results showed that there were six genotypes：QX genotype （54 isolates，78.26%），Mass genotype（6 isolates，8.7%），4/91 genotype（3 isolates，4.35%），TW-I genotype（2 isolates，2.90%），t1/CH/LDT3/03 genotype（2 isolates，2.90%）and CK/CH/LSC/99I genotype（2 isolates，2.90%）.All S1 gene sequences of IB isolates in China from GenBank from 2012 to 2014 were downloaded，and the phylogenetic tree was built up. The results of this study proved that IBV QX genotype was predominant in China.

Key words：epidemiological investigation；avian infectious bronchitis virus；homology comparison；consistency；QX type