劉　慧，李海劍，高傳玉，毛紹芬，陶雅非，任東升

(1.河南省南陽市中心醫(yī)院特需一科　473009；2.河南省南陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科　473009；3.河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450003)

?

PAPP-A的表達(dá)及基因多態(tài)性與冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系*

劉慧1，李海劍2#，高傳玉3，毛紹芬1，陶雅非2，任東升2

(1.河南省南陽市中心醫(yī)院特需一科473009；2.河南省南陽市中心醫(yī)院腎內(nèi)科473009；3.河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450003)

[摘要]目的探討妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的表達(dá)及基因多態(tài)性與冠心病患者冠狀動(dòng)脈(以下簡稱冠脈)病變程度的關(guān)系。方法選取來河南省南陽市中心醫(yī)院就診的冠心病患者98例(觀察組)，根據(jù)冠脈造影檢查結(jié)果將患者分為單支病變組和多支病變組。選取同期來該院健康體檢者98例(對照組)，分別于患者就診時(shí)和對照組體檢時(shí)抽取靜脈血，采用ELISA法檢測血清PAPP-A的蛋白水平，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測PAPP-A基因的IVS6+95多態(tài)性。結(jié)果與對照組比較，觀察組患者外周血PAPP-A蛋白水平明顯升高(P<0.05)，而多支病變組患者外周血PAPP-A蛋白水平明顯高于單支病變組患者(P<0.05)。外周血PAPP-A水平與冠脈病變程度呈正相關(guān)。PAPP-A基因IVS6+95位點(diǎn)存在3種基因型，包括CG雜合型、CC純合型和GG純合型。其中多支病變患者CC純合型位點(diǎn)基因頻率明顯高于單支病變組患者(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)APP-A蛋白水平及IVS6+95多態(tài)性與冠心病患者冠脈病變程度存在密切關(guān)系，CC基因型患者可能是冠心病患者遺傳易感性基因標(biāo)志之一。

[關(guān)鍵詞]冠心??；妊娠相關(guān)血漿蛋白A；基因多態(tài)性；冠狀動(dòng)脈病變程度

冠心病是臨床常見的心腦血管疾病之一，其由于冠狀動(dòng)脈(以下簡稱冠脈)粥樣硬化斑塊形成或血管痙攣引起管腔阻塞或狹窄導(dǎo)致缺血缺氧性的心臟疾病，其發(fā)病率高、致死率高，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的主要疾病之一[1-2]。冠心病的臨床病理學(xué)變化的主要特征是冠脈粥樣硬化斑塊形成、不穩(wěn)定斑塊破裂、血小板聚集、繼發(fā)血栓形成，引起冠脈阻塞[3-5]。大量研究顯示，炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成，增加不穩(wěn)定斑塊的形成，而炎癥因子在功能及表達(dá)水平的異常主要是由相關(guān)基因表達(dá)異常所致，因此，認(rèn)為冠心病可能存在易感基因。妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein-A，PAPP-A)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，是主要的炎癥因子之一，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和破裂過程中發(fā)揮著重要作用[6]。有研究顯示，PAPP-A與不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化板塊形成和缺血性腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切[7-8]。此外，PAPP-A基因存在單核苷酸基因多態(tài)性，而這種現(xiàn)象與冠心病存在一定的關(guān)系。但是目前關(guān)于PAPP-A的表達(dá)水平及PAPP-A基因多態(tài)性與冠脈病變程度的研究尚少見報(bào)道，作者在臨床研究中發(fā)現(xiàn)其存在一定相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年6月至2014年6月南陽市中心醫(yī)院住院部收治的98例冠心病患者作為觀察組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均確診為冠心??；(2)患者臨床資料完整；(3)患者均行冠脈造影術(shù)(CAG)；(4)所有患者均簽署知情同意書；(5)本研究經(jīng)南陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)許可并在其監(jiān)督下完成。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在急性或者慢性炎癥患者；(2)存在進(jìn)展性心、肝、腎衰竭者；(3)腫瘤患者。根據(jù)患者CAG的結(jié)果以冠脈主要血管大于或等于50%狹窄視為診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為單支病變組和多支病變組。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的98例患者中男56例，女42例；年齡51～73歲，平均(61.40±10.20)歲。其中單支病變組30例，男19例，女11例，平均年齡(62.80±11.90)歲；多支病變組68例，男43例，女25例，平均年齡(62.50±12.10)歲。選取同期來南陽市中心醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)健康體檢者98例作為對照組，其中男60例，女38例，年齡52～73例，平均(61.90±10.10)歲。各組對象年齡、性別等指標(biāo)比較比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑PAPP-A ELISA試劑盒購自羅氏/ROCHE公司；基因組提取試劑盒購自天根生物有限公司；PAPP-A引物由上海生工合成；Dntp、EXTaq酶和PCR儀均購自TAKARA公司；MOWI限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司(R0573L)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.2標(biāo)本采集觀察組患者于住院次日清晨抽取靜脈血5 mL，對照組于體檢時(shí)抽取靜脈血5 mL。兩組血液樣本分為兩份，一份3 000 r/min離心10 min，血清用于檢測PPAP-A的表達(dá)水平；另一份收集白細(xì)胞，用于提取基因組，檢測PAPP-A基因單核苷酸多態(tài)性。

1.2.3ELISA檢測血清PAPP-A水平ELISA檢測PAPP-A水平嚴(yán)格按照試劑盒操作指南進(jìn)行，先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定患者血清樣本中PAPP-A的OD值，于標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出血清中PAPP-A水平。

1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測PAPP-A基因多態(tài)性離心收集外周血白細(xì)胞，采用基因組提取試劑盒提取白細(xì)胞基因組，根據(jù)Gene Bank提供的PAPP-A基因組序列，合成以下引物。PAPP-A-F：5′-GTG GCT GCG AGC GGA GGG GG-3′，PAPP-A-R：5′-CTT CAC ATT GTC CCA GTT CTC CTG-3′。對合成引物的退火溫度及特異性進(jìn)行鑒定。然后配制以下50 μL反應(yīng)混合物：10×EXTaq酶 buffer 5 μL，PAPP-A-F 引物(10 nmol/L)1 μL，PAPP-A-R引物(10 nmol/L)1 μL，dNTP 4 μL，EXTaq酶 1 μL，用水補(bǔ)至50 μL。然后按照下述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，PCR循環(huán)30個(gè)。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析PCR條帶的特異性。取10 μL PCR產(chǎn)物采用MOWI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系如下：PCR產(chǎn)物10 μL，10×內(nèi)切酶buffer 2 μL，MOWI限制性內(nèi)切酶 1 μL，用雙蒸水補(bǔ)至20 μL，然后置于37 ℃水浴中酶切2 h，然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析DNA片段。

1.2.5CAG檢查所有患者在住院治療期間進(jìn)行CAG檢查，造影的路徑有檢查醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇，分別進(jìn)行左、右CAG，常規(guī)取左前斜30°、右前斜45°和頭足軸狀位投影，觀察冠脈的病變支數(shù)和狹窄程度。造影結(jié)果由4位經(jīng)驗(yàn)豐富的?？漆t(yī)生進(jìn)行判斷，以各個(gè)投照體位中病變最大狹窄程度為病變狹窄程度。

2結(jié)果

2.1各組對象相關(guān)資料比較各組對象在年齡和性別等指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單支病變和多支病變組在吸煙、高血壓、高血脂和糖尿病等比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　　各組對象相關(guān)資料比較

a：P<0.05，與對照組比較。

2.2各組對象PAPP-A水平比較各組對象PAPP-A蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線r=0.997，線性良好，可用于衡量患者外周血中PAPP-A水平變化。與對照組比較，單支病變和多支病變組患者外周血中PAPP-A水平明顯升高(P<0.05)；與單支病變組比較，多支病變組患者外周血中PAPP-A蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖1。相關(guān)性分析顯示，PAPP-A與冠心病的發(fā)生呈正相關(guān)(r=1.368，P<0.05)，而且與冠脈病變程度也呈正相關(guān)(r=1.791，P<0.05)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與單支病變組比較。

2.3觀察組PAPP-A基因IVS6+95位點(diǎn)多態(tài)性分析實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增出了長度為500 bp的DNA片段，采用MOWI限制性內(nèi)切酶單酶切，出現(xiàn)了3種不同的條帶類型。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)包括3種基因型：CC純合性(500 bp)，GG純合型(450、50 bp)和CG雜合型(500、450、50 bp)，見圖2。由于基因位點(diǎn)為C堿基時(shí)MOWI酶切位點(diǎn)不存在，因此無法切割成小片段。

2.4觀察組PAPP-A基因IVS6+95位點(diǎn)基因型與冠脈病變程度的關(guān)系單因素方差分析結(jié)果顯示，CC基因型患者發(fā)生多支冠脈病變的例數(shù)明顯高于單支病變患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CG和GG基因型患者發(fā)生單支冠脈病變和多支冠脈病變比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

">1：未酶切片段； 2：CG雜合型； 3：GG純合型； 4：CC純合型；5：Marker。

表2　　PAPP-A基因IVS6+95位點(diǎn)基因型與冠脈病變程度的關(guān)系[n(%)]

3討論

冠心病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，但是目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的研究尚不完全明確，研究顯示遺傳、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖和高血脂均是導(dǎo)致冠心病的高危因素。冠心病的病理學(xué)基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈斑塊的形成，而炎癥在上述病理過程中發(fā)揮著重要作用。PAPP-A是一種炎癥介質(zhì)，其最早被應(yīng)用于孕婦中唐氏綜合征等先天性疾病的篩查[9]。但是后來發(fā)現(xiàn)PAPP-A在急性心肌梗死破裂的斑塊中高水平表達(dá)，說明PAPP-A在急性心肌梗死過程中發(fā)揮著重要角色[8,10]。后續(xù)的大量研究證實(shí)，PAPP-A在冠心病患者血清中異常表達(dá)[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血中PAPP-A水平明顯高于健康者。

冠脈病變是冠心病的主要特征，冠脈病變程度直接與患者預(yù)后密切相關(guān)[13]。目前尚少有冠脈病變程度與PAPP-A表達(dá)水平關(guān)系的報(bào)道。本研究分析顯示，單支冠脈病變患者外周血中PAPP-A的表達(dá)水平低于多支冠脈病變患者，此外，相關(guān)性分析也顯示PAPP-A的表達(dá)水平與冠脈病變程度之間呈正相關(guān)(r=1.791，P<0.05)?？赡艿臋C(jī)制是PAPP-A是炎癥介質(zhì)，其表達(dá)水平越高則暗示機(jī)體炎癥水平越高，而炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展中起著重要作用，是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此PAPP-A在動(dòng)脈粥樣硬化病變程度中起著關(guān)鍵作用。

遺傳因素是導(dǎo)致冠心病發(fā)生的一個(gè)重要因素，有研究報(bào)道顯示，PAPP-A存在IVS6+95位點(diǎn)的基因多態(tài)性[14-15]。本研究進(jìn)一步分析了PAPP-A的基因多態(tài)性與冠脈病變程度的關(guān)系，通過PCR、限制性內(nèi)酶切和測序顯示PAPP-A IVS6+95存在3種不同基因型，分別為CC純合性、GG純合型和CG雜合型。本研究結(jié)果顯示，多支病變患者PAPP-A IVS6+95 CC基因型的頻率明顯高于單支病變患者，提示CC基因型可能是冠心病患者遺傳易感性基因標(biāo)志之一，可能與患者冠狀動(dòng)脈病變程度有關(guān)。

綜上所述，冠心病患者外周血PAPP-A蛋白的表達(dá)水平明顯高于健康者，且與冠脈病變程度呈正相關(guān)。PAPP-A IVS6+95 CC基因型可能是冠心病患者遺傳易感性基因標(biāo)志之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Mente A,De Koning L,Shannon HS,et al.A systematic review of the evidence supporting a causal Link between dietary factors and coronary heart disease[J].Arch Intern Med,2009,169(7):659-669.

[2]Iacobellis G,Corradi D,Sharma AM.Epicardial adipose tissue:anatomic,biomolecular and clinical relationships with the heart[J].Nat Clin Pract Cardiovasc Med,2005,2(10):536-543.

[3]Noyes AM,Dua K,Devadoss R,et al.Cardiac adipose tissue and its relationship to diabetes mellitus and cardiovascular disease[J].World J Diabetes,2014,5(6):868-876.

[4]Wang CP,Hsu HL,Hung WC,et al.Increased epicardial adipose tissue (EAT) volume in type 2 diabetes mellitus and association with metabolic syndrome and severity of coronary atherosclerosis[J].Clin Endocrinol (Oxf),2009,70(6):876-882.

[5]Poirier P,Giles TD,Bray GA,et al.Obesity and cardiovascular disease:pathophysiology,evaluation,and effect of weight loss:an update of the 1997 American Heart Association Scientific Statement on Obesity and Heart Disease from the Obesity Committee of the Council on Nutrition,Physical Activity,and Metabolism[J].Circulation,2006,113(6):898-918.

[6]Li Y,Zhou C,Zhou X,et al.Pregnancy-associated plasma protein A predicts adverse vascular events in patients with coronary heart disease:a systematic review and meta-analysis[J].Arch Med Sci,2013,9(3):389-397.

[7]Kalousová M,Zima T,Krane V,et al.Pregnancy-associated plasma protein A associates with cardiovascular events in diabetic hemodialysis patients[J].Atherosclerosis,2014,236(2):263-269.

[8]Khan NU,Khan FA,Khan DA,et al.Pregnancy-associated plasma protein-A levels in individuals with and without coronary artery disease[J].J Coll Physicians Surg Pak,2011,21(8):450-454.

[9]Lodh M,Goswami B,Parida A,et al.Assessment of serum leptin,pregnancy-associated plasma protein A and CRP levels as indicators of plaque vulnerability in patients with acute coronary syndrome[J].Cardiovasc J Afr,2012,23(6):330-335.

[10]Lin TM,Galbert SP,Kiefer D,et al.Characterization of four human pregnancy-associated plasma proteins[J].Am J Obstet Gynecol,1974,118(2):223-236.

[11]KhanDA,SharifMS,KhanFA.Diagnosticperformanceofhigh-sensitivitytroponinT,myeloperoxidase,andpregnancy-associatedplasmaproteinAassaysfortriageofpatientswithacutemyocardialinfarction

[J].Korean J Lab Med,2011,31(3):172-178.

[12]Mei WY,Du ZM,Zhao Q,et al.Pregnancy-associated plasma protein predicts outcomes of percutaneous coronary intervention in patients with non-ST-elevation acute coronary syndrome[J].Heart Lung,2011,40(3):e78-83.

[13]Bonaca MP,Scirica BM,Sabatine MS,et al.Prospective evaluation of pregnancy-associated plasma protein-a and outcomes in patients with acute coronary syndromes[J].J Am Coll Cardiol,2012,60(4):332-338.

[14]Kalousová M,Jáchymová M,Muravská A,et al.Cys327Cys polymorphism of the PAPP-A gene (pregnancy associated plasma protein A) is related to mortality of long term hemodialysis patients[J].Clin Biochem,2014,47(7/8):578-583.

[15]Jia J,Li L,Zhao Q,et al.Association of a single nucleotide polymorphism in pregnancy-associated plasma protein-A2 with developmental dysplasia of the hip:a case-control study[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(1):60-63.

Relationship between serum PAPP-A expression and gene polymorphism with severity of coronary lesions in patients with coronary heart disease*

LiuHui1,LiHaijian2#,GaoChuanyu3,MaoShaofen2,TaoYafei2，RenDongsheng2

(1.FirstDepartmentofSpecialNeed;2.DepartmentofNephrology,NanyangMunicipalCentralHospital,Nanyang,Henan473009,China;3.DepartmentofCardiology,HenanProvincePeople′sHospital,Zhengzhou,Henan450003,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between serum pregnancy associated plasma protein A (PAAA-A) expression and gene polymorphism with the severity of coronary lesions in the patients with coronary heart disease(CHD).MethodsNinety-eight patients with CHD in the Nanyang Municipal Central Hospital were selected as the observation group and divided into single vessel lesion group and multiple vessel lesion group according to coronary angiographic results.Ninety-eight individuals undergoing healthy physical examination were selected as the control group.The venous blood was collected at the visiting hospital in the observation group and at the physical examination in the control group for detecting the serum PAPP-A protein level by ELISA.PAPP-A gene and IVS6+95 polymorphism were analyzed by adopting polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR-RELP).ResultsCompared with the control group,peripheral blood PAPP-A protein level in the observation group was significantly increased(P<0.05),moreover the PAPP-A protein level in the multiple vessel lesion group was significantly higher than that of the single vessel lesion group (P<0.05).The peripheral blood PAPP-A level was positively correlated with the severity of CHD.Three genotypes existed in PAPP-A gene IVS6+95 locus,including CG heterozygous,homozygous CC and GG homozygous type.The CC homozygous allele frequency in the patients with multiple vessel lesion was higher than that in the patients with single vessel lesion (P<0.05).ConclusionThe PAPP-A protein level and IVS6+95 polymorphism have a close relation with the severity of coronary lesions in patients with CHD.CC genotype may be one of genetic susceptibility gene markers in the patients with CHD.

[Key words]coronary heart disease;pregnancy-associated plasma protein-A;gene polymorphism;severity of coronary artery lesion

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.012

基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(324410084)。

作者簡介：劉慧(1978-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事冠心病的診斷與治療。#共同第一作者：李海劍(1977-)，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事冠心病和慢性腎衰的防治研究。

[中圖分類號]R541.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2488-03

(收稿日期：2015-11-22修回日期：2016-03-09)